论文部分内容阅读
果聚糖蔗糖酶(Levansucrase,EC 2.4.1.10)是糖基转移酶家族的一员,在微生物中广泛存在。果聚糖蔗糖酶因其具有水解、转果糖基、聚合等作用,在果聚糖(Levan)、低聚糖等功能性食品配料的生物合成方面有重要应用。本课题主要研究利用重组Leuconostoc mesenteroides B-512 FMC果聚糖蔗糖酶的转果糖基作用在合成低聚乳果糖和蜜二糖方面的应用。低聚乳果糖(Lactosucrose),可以由蔗糖和乳糖通过转糖基作用来酶法合成,是一种新型三糖,由果糖基、葡萄糖基、半乳糖基组成。因其不能被人体消化利用却可以促进肠道双歧杆菌增殖等作用而可以被作为一种益生元。蜜二糖(Melibiose),是一种广泛存在于植物组织中的天然二糖,从结构上由半乳糖基和葡萄糖基通过α-1,6连接键连接,因其生理功能和潜在的商业价值近来受到关注,但目前关于其生物合成的报道较少。来源于Leuconostoc mesenteroides B-512 FMC的编码果聚糖蔗糖酶的基因序列在GenBank数据库的登录号为AY665464,基因片段全长1275 bp,合成基因并构建重组质粒。用IPTG诱导重组果聚糖蔗糖酶在大肠杆菌中的过量表达。胞内提取的粗酶液通过Ni2+亲和层析纯化得到重组酶。经SDS-PAGE电泳,结果显示蛋白分子量约45 kDa,与酶的计算分子量相符,凝胶色谱结果显示蛋白分子量为94 kDa,推测重组酶为二聚体。果聚糖蔗糖酶酶学性质测定显示,其对蔗糖、棉籽糖水解的最适pH和温度分别为pH 6.0和45oC,加入Ca2+和Ba2+能提高酶活达10%以上。蔗糖水解时的动力学参数分别为:米氏常数(Km)为25.66±1.21 mM,催化效率(kcat/Km)为2901±26/(mM min),以棉籽糖为底物时,Km和kcat/Km分别为56.82±1.56 mM和112±8/(mM min)。在果聚糖蔗糖酶的催化下,以蔗糖和乳糖为底物进行转糖基反应,对反应产物进行1D NMR及2D NMR鉴定,判定转糖基产物为O-β-D-半乳糖基-(1,4)-O-α-D-葡萄糖基-(1,2)-β-D-果糖,即低聚乳果糖。研究pH、温度、底物浓度、底物配比、加酶量等条件对低聚乳果糖合成量的影响,得到在pH 6.5、50oC、27%(w/v)蔗糖、27%(w/v)乳糖以及加酶量为5 U/mL的条件下,反应1 h后,低聚乳果糖可达到最高浓度224 g/L。本研究利用纯酶进行低聚乳果糖的合成研究,产物除低聚乳果糖、葡萄糖、果糖外,无其它副产物生成。本文还探究了以棉籽糖为转果糖基供体时,分别以水、半乳糖、乳糖为受体进行水解、转糖苷反应。对主要反应进行核磁鉴定,通过比对确定棉籽糖失去果糖基转化为蜜二糖,乳糖和半乳糖分别接受果糖基形成α-1,2连接键,转化为低聚乳果糖和半乳糖-1,2-果糖。在加酶量为5 U/m L,45oC,pH 6.0的条件下,研究了棉籽糖(300 m M)水解,反应2.5 h后,转化率达到46%。在加酶量为5 U/mL,50oC,pH 6.5的条件下,以棉籽糖(300 mM)为果糖基供体,并分别以乳糖(300 mM)、半乳糖(300 mM)为受体进行转糖基反应,反应2.5 h后,生成的蜜二糖的转化率分别为52%、62%。