白内障目前是世界上影响人类健康的常见病,是我国的第一位致盲疾病,发病机制尚不十分清楚,它的发生与多种因素有关,是多种因素综合作用的结果,比如晶体蛋白基因突变、氧化损伤、辐射、老化、葡萄糖、半乳糖等代谢障碍、脂质过氧化物损伤等,发病的关键环节是晶状体发生混浊,影响光线经过晶状体的透射和折射,从而造成视物不清。 晶状体位于瞳孔虹膜后方、玻璃体前方,含有高浓度蛋白质,其蛋白质含量为晶状体湿重的33％,主要包括晶状体蛋白(crystallins)、膜蛋白(membrane protein)和细胞骨架蛋白(cytosteletal protein)。按溶水与否可分为可溶性蛋白(晶状体蛋白)、非可溶性蛋白(膜蛋白、细胞骨架蛋白、聚合的晶状体蛋白)。其中可溶性蛋白即晶状体蛋白主要为结构蛋白,早期约占整个晶状体蛋白质的80～90％,它与周围的细胞骨架蛋白相互结合,整齐排列,保持晶状体的透光性。晶状体蛋白根据其在电场中的相对迁移能力,主要分为α、β、γ三类晶体蛋白。晶状体的透光性取决于它所含的蛋白质复杂有序的结构和独特的蛋白质构成。因此通过研究晶体蛋白的结构和功能,能够更好的阐明白内障的发病机制。 目前α-对晶体蛋白的功能研究比较广泛,它的分子伴侣作用已得到世界公认,其功能是介导其他蛋白质的正确折叠和装配,在其他蛋白质处于易感状态时,可保护其免受损伤,主要表现为抑制各种蛋白质的聚集和酶的失活。对β-晶体蛋白的研究还比较少,其中βB2-晶体蛋白在β族晶体蛋白中含量最高,而且它的水溶性成份呈年龄依赖性增高,因此,它的正常结构及其水溶性成份水平,对维持晶状体的高折射系数和透明至关重要。这种反常性增高势必包含了它在维持晶状体透光性中的重要作用,因此对于它的功能值得进一步研究。 晶体蛋白基因敲除是研究晶体蛋白功能的一个重要手段,已有研究证明α-晶体蛋白基因敲除可以导致白内障,而且α或β-晶体蛋白基因突变也可以导致白内障。目前国内外尚未有βB2-晶体蛋白基因敲除动物模型的报道,因此我们选择此蛋白作为靶点,利用pB2-晶体蛋白基因敲除小鼠模型,来研究该蛋白在维持晶状体透明性中的作用。对白内障的基础研究已有一定的基础,本文主要通过观察βB2-晶体蛋白基因敲除后对小鼠晶状体生长发育情况的影响,并通过体内及体外实验检测晶体蛋白的功能,分析该蛋白在维持晶状体透明以及在白内障发病中的作用。 主要方法： 1.βB2-晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立及鉴定 此部分工作是应我室要求,与美国纽约iGTL实验室合作并最终在美国iGTL实验室完成,最后以馈赠方式供我室专用。小鼠品系为C57BL/C小鼠,小鼠模型为10只杂合子,已成功在本室进行繁殖,子代小鼠生长发育状况良好,现已繁殖30余代。杂合小鼠繁殖的后代可以是杂合、纯合或野生型。 取鼠尾末端组织,通过PCR技术对小鼠基因型进行鉴定；取小鼠眼晶状体进行匀浆离心后取上清液,通过Western blot技术对晶体蛋白的表达进行鉴定。鉴定后将小鼠分类饲养繁殖。 2.βB2-晶体蛋白基因敲除小鼠晶状体结构和发育特征 定期用裂隙灯显微镜观察晶状体的发育情况及白内障的发生和演变过程。白内障形成后,取出晶状体经过处理后用透射及扫描电子显微镜观察晶状体的超微结果。取各个鼠龄的小鼠晶体蛋白做双向凝胶电泳检测。定期测量小鼠体重、晶状体湿重及其最大直径,观察βB2-晶体蛋白缺失对小鼠晶状体生长发育状况的影响。 3.βB2-晶体蛋白的功能分析 剥离出生后8周的βB2-晶体蛋白基因敲除小鼠和野生型小鼠眼晶状体,采用TC-199培养液做离体晶状体培养,放入CO2培养箱2小时后,用H2O2诱导离体晶状体氧化损伤,通过晶状体混浊程度分析其抗氧化损伤能力。剥离βB2-晶体蛋白基因敲除小鼠眼晶状体,匀浆离心后取上清液,50℃连续加热使蛋白变性,每5分钟测定吸光度值,分析其热稳定性；将上述上清液中加入一定比例的H2O2,诱导氧化损伤,每15分钟测定吸光度值,可以反映晶体蛋白对氧化损伤的耐受性。 实验结果： 1.βB2-晶体蛋白基因敲除小鼠模型建立后,PCR技术成功检测出三种基因型：纯合、杂合及野生型小鼠。经Western blot鉴定,纯合小鼠晶体蛋白未检测到βB2-晶体蛋白的表达,杂合及野生型小鼠晶体蛋白在分子量23KD处检测到该蛋白的表达。 2.βB2-晶体蛋白基因敲除后导致了小鼠白内障的发生,最早发生于出生后8周左右。由βB2-晶体蛋白基因敲除所致的白内障均发生在前或后皮质部,随年龄增加,皮质混浊程度逐渐加重。电子显微镜显示纯合小鼠晶状体纤维扭曲紊乱。纯合小鼠晶状体湿重及最大直径均小于同龄野生型小鼠。 3.经体外培养的纯合小鼠晶状体氧化易感性高,晶体蛋白匀浆上清液的热稳定性低,氧化易感性高。 结论： 1.βB2-晶体蛋白基因敲除可以导致白内障的发生,最早发生于8周鼠龄,为皮质性白内障,皮质混浊程度随年龄增加而增加。 2.βB2-晶体蛋白的缺失可以降低晶状体对热变性及氧化变性的抵抗能力。