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隐孢子虫是一种全球普遍存在的人兽共患寄生虫,可引起人和动物的严重腹泻甚至死亡。目前隐孢子虫病尚无有效的治疗药物和预防疫苗,其防治主要依赖于保护易感宿主,加强患病病人和动物的管理,搞好周边环境卫生,管理好病人以及病畜的粪便,减少其卵囊对食物、饮水及环境的污染,预防和减少人、动物的感染。动物隐孢子虫病不仅对其自身造成严重危害,也是人隐孢子虫病的重要感染源。因此,亟待建立灵敏、高效、价廉的分子检测技术,广泛开展隐孢子虫病的分子流行病学调查,摸清动物隐孢子虫的感染状况、流行特点、寄生虫种及基因型,为预防和减少疾病的危害奠定基础。另一方面,微小RNA(microRNA,miRNA)能在转录后水平调控基因表达,参与生物体许多重要生理过程的调控,开展miRNA研究对于探讨重要基因的生物学功能、揭示寄生虫生长发育机制及寄生虫与宿主相互作用关系等诸多领域具有重要价值,然而至今尚未见隐孢子虫属miRNA的相关报道。为建立更为敏感的隐孢子虫PCR检测技术,本研究首先比较了10种基因组DNA提取方法抽提的隐孢子虫卵囊DNA作为模板进行nested PCR扩增的效果。三次重复试验结果显示,Chelex 100法、FTA试纸法和Wizard DNA Clean-Up System试剂盒法抽提效果最好,对1×102及以上个卵囊提取的DNA模板均能得到稳定的扩增。对于样品中含有较多PCR抑制物的奶牛源微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)与PCR抑制物相对较少的小鼠源隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)卵囊,利用Chelex-100法提取DNA模板后,其nested PCR扩增效果一致。对牦牛的田间样品检测结果显示,PCR方法检出率明显高于蔗糖漂浮法,用上述3种敏感性最高的方法提取DNA模板后,进行nested PCR扩增的检出率为33.3%-44.4%。对山羊、猪、鸭三种动物的192份田间样品进行检测,以蔗糖漂浮法作金标准,结果以FTA试纸法抽提DNA模板后进行PCR扩增,其阳性符合率和总符合率分别高达89.1%和67.7%,表明该方法经优化后,适用于各种动物隐孢子虫病的田间分子流行病学调查。采用Sheather’s蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法及nested PCR-RFLP技术,对上海市7个区/县19个奶牛场,9个区/县12个猪场,3个区4个养鸡场,4个区7个鸭场,7个区14个犬场、诊所及动物试验场,3个区3个羊场中相应动物隐孢子虫感染情况进行了调查,分别随机采集样品826、2,323、683、857、446份进行检测,结果其阳性率分别为22.3%、34.4%、29.4%、21.9%、2.47%、26.3%,初步查明了上海地区几种重要畜禽隐孢子虫病的流行现状和特点。发现猪隐孢子虫感染存在明显的日龄相关性和季节相关性,2月龄以内仔猪和冬、春两个低温季节是开展隐孢子虫病查、防的有利时机和关键时段。此外,还对鹌鹑、梅花鹿、新西兰白兔、东方田鼠、实验小鼠、鸽子、黑天鹅、猫中隐孢子虫感染状况进行了检测,结果其阳性率分别为63.3%、36.6%、11.0%、54.5%、2.9%、0、0、0;在1头黄牛粪便中也发现有隐孢子虫卵囊,显示上海地区多种动物普遍存在隐孢子虫感染。对170多份样品的分子检测显示,感染奶牛的隐孢子虫为C. parvum、C. andersoni、C. ryanae和C. bovis 4种;猪为C. suis和pig genotypeⅡ;鸡为C. baileyi;鸭为C. baileyi,Cryptosporidium duck genotype;犬为C. canis、C. muris和mouse genotype;山羊为C. ubiquitum;鹌鹑为C. meleagridis;梅花鹿为C. andersoni;兔为C. cuniculus;小鼠为Cryptosporidium mouse genotype。其中北京鸭感染duck genotype、山羊感染C. ubiquitum、犬感染mouse genotype在世界各地尚未见报道。C. canis、duck genotype在中国尚未见鉴定报道;犬感染C. muris和C. canis、梅花鹿感染C. andersoni等在中国尚未见报道。上述结果的取得,对有效实施防治措施具有重要指导意义。利用Solexa高通量测序技术,对C. parvum小分子RNA序列进行了测定与生物信息学分析。共获得15,025,804条序列,其中高质量序列14,753,144条,干净序列337,432种12,566,783条。基因组定位分析显示,有17,877种小RNA比对上基因组,占总种类数的5.30%,不同染色体上小RNA的分布不均匀,分别占0.5%-48.0%。将这些小RNA进行分析,结果共获得30种miRNA家族,其表达量从1-1,405。利用生物信息学软件预测,获得了2个候选的miRNA及4,032个靶基因位点。利用加尾和引物延伸定量RT-PCR,证实了其中至少有12种miRNA在C. parvum、C. baileyi、Cryptosporidium mouse genotype、C. cuniculus、C. suis和C. andersoni中的3-6种中存在表达。上述工作拓宽了对顶复器门原虫miRNA的理解和认识,为利用miRNA开展隐孢子虫生物学和防治技术研究打下了基础。本研究优化了隐孢子虫nested PCR检测技术,对上海地区13种动物隐孢子虫的感染状况进行了调查,对寄生的隐孢子虫虫种和基因型进行了分子鉴定,对微小隐孢子虫的miRNA进行了初步鉴定,为开展隐孢子虫生物学研究、预防和减少隐孢子虫病的危害奠定了基础。