海参是海洋无脊椎动物的典型代表,近年来对海参的研究多集中在养殖、产品深加工和药用活性方面,而从基因水平研究其体内所含功能蛋白的报道则较少。本研究对海刺参体内的溶菌酶基因进行高效表达,为进一步研究海参的生长、新陈代谢以及自溶现象提供了理论基础。溶菌酶(lysozyme)是一种能水解粘多糖的碱性酶,它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酞胞壁酸和N-乙酞氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键的水解,导致细菌细胞壁破裂、内容物逸出而使细菌死亡。溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的组成部分,参与机体多种免疫反应,能改善和增强巨噬细胞吞噬能力和消化功能,在溶菌过程中形成一个水解体系,破坏和消除侵入体内的异物,从而实现机体的免疫防御。溶菌酶本身是一种蛋白质,安全性能高,在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。商品溶菌酶多由蛋清中提取,仅对革兰氏阳性菌有作用,限制了其应用范围,近年来国内外对多种来源的溶菌酶进行了广泛的研究,但有关海洋生物溶菌酶的研究报道较少。本研究采用基因工程技术从海参中克隆得到的Sjlys基因,其完整的阅读框全长为438bp,编码145个氨基酸。其中前21个氨基酸为信号肽,成熟肽包含125个氨基酸。重组表达时,我们去掉了信号肽,只扩增了成熟肽的125个氨基酸。以海刺参(Stichopus japonicus)为材料提取总RNA,以总RNA为模板进行特异引物的RT-PCR扩增,得到海刺参i型溶菌酶的基因(GenBank accession number:EF036468)的cDNA片段,并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a(+)-SjLys,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。挑取阳性克隆子,IPTG诱导表达,并确定最佳诱导表达条件为：2号菌株扩大培养,30℃、0.5mMIPTG浓度诱导4h。目的蛋白以不溶的包涵体的形式表达,表达量占细菌总蛋白的30%。阳性克隆子经诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了酶活力为19.2U/mg的重组SjLys (rSjLys)。对纯化复性得到的重组蛋白SjLys进行抗菌活性检测,通过管碟法和抑菌谱实验,确定重组蛋白SjLys有抗菌活性。相对鸡蛋清溶菌酶只对革兰氏阳性菌有抑菌作用而言,该重组海参溶菌酶SjLys对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用,尤其对海产品中常见的革兰氏阴性致病菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌有明显的抑制作用。热处理失活后的SjLys重组蛋白仍然具有抑菌活性,而且抑菌能力要比热处理前的SjLys提高9%-25%。上述结果表明,海刺参溶菌酶是一种具有糖苷酶活性和非酶抑菌活性的特殊的i型溶菌酶,且具有很广的抑菌活性,在海刺参机体先天免疫系统中是一个重要的效应分子。