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目的:肝细胞癌（肝细胞型肝癌）是一种原发性肝癌，也是常见的消化道恶性肿瘤之一。肝细胞癌早期症状不明显，患者就医时，多数已经发展到了中晚期，失去了外科手术治疗的最佳时机。其他的治疗方法虽然众多，但目前所有对肝细胞癌的治疗方法还没有达到令我们满意的效果，因此急需一种能有效治疗肝细胞癌的方法。 肝硬化被认为是肝细胞癌的前期病理改变。C型肝炎病毒感染，过度饮酒和脂肪肝是引起肝硬化的主要因素。尽管肝细胞癌发病的分子机理尚不清楚，但综合以前的研究，目前认为以下因素和肝细胞癌的发病有一定关系。(1)某些肿瘤基因调节的异常改变。如c-MYC，cyclin D1和β-catenin。(2)肿瘤抑制基因的改变。如pRb，DLC-1，P16INK4A，P53和E-cadherin。(3)全基因组DNA低甲基化和基因启动子CpG区域高甲基化的改变。 在肝细胞癌等实体肿瘤中，由于肿瘤细胞的快速生长和瘤体内血管形成异常，导致瘤体内出现缺氧区域。在缺氧区域内，缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达显著升高。缺氧诱导因子调节肿瘤细胞的生长、代谢、生存、迁移以及肿瘤实体内血管的形成，最新研究表明缺氧调节细胞内的DNA甲基化水平。在甲基转移酶(DNMTs)的催化下，DNA链上两个相邻的核苷酸，胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)，胞嘧啶的第五位C被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。DNA甲基化是机体调节基因表达的一种方式。Anjana Rao等人在2009年报道哺乳动物细胞有一种DNA双加氧酶，即TET酶，可将5-甲基胞嘧啶氧化成5-羟基胞嘧啶（5-hmC）。这种变化减少了DNA的甲基化，起到了基因活化的作用，增加了基因的表达。 最近的研究表明在肝细胞癌的组织样品中5-羟基化胞嘧啶的含量和TET酶的表达水平和肝细胞癌周围的正常组织相比显著减少[13]。其他的研究表明低氧可在一些肿瘤细胞如SK-N-BE，NBL-WN，La1-55n，MCF7，和MDA-MB-231中，诱导TET1或TET3的表达，提高5-羟基化胞嘧啶的含量[37,38]。 目前，在体外研究肝细胞型肝癌的最佳、最广泛使用的是HepG2和Hep3B细胞株。本研究同时使用了HepG2和Hep3B两种细胞株，拟探讨缺氧在肝细胞型肝癌HepG2和Hep3B细胞中对TET酶的调节作用及其作用机制。 主要结果和结论:一、缺氧能够诱导肝癌细胞HepG2和Hep3B中TET酶的表达，升高细胞内5-羟基胞嘧啶的含量 1、HepG2和Hep3B细胞表达三种TET酶亚型:TET1、TET2和TET3。用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(quantitative real-time PCR)的方法检测三种亚型在1％、5％和21％氧气浓度条件下在HepG2和Hep3B细胞内的表达。结果显示TET1，TET2和TET3的表达在1％的氧气条件下显著高于21％的氧气条件，表明缺氧能诱导TET酶的表达。 2、HepG2和Hep3B细胞培养在1％的氧气浓度下，检测TET酶三种亚型在不同时间的表达水平，如4小时，8小时，24小时。结果显示TET1，TET2和TET3的表达在8小时时明显升高，更加确认了缺氧可诱导TET酶的表达。 3、用免疫荧光化学的方法检测到5-羟基胞嘧啶在细胞核的表达，结果显示在1％的氧气浓度条件下，5-羟基胞嘧啶的表达水平明显高于21％的氧气浓度，表明缺氧时细胞内5-羟基胞嘧啶的含量增加。 4、用点杂交的方法，定量检测细胞内的5-羟基胞嘧啶含量，结果显示在1％的氧气浓度条件下，5-羟基胞嘧啶的水平显著升高，表明缺氧能升高细胞内5-羟基胞嘧啶的水平。 二、缺氧是通过缺氧诱导因子激活TET酶启动子的表达来诱导TET酶的表达 1、氯化钴和缺氧一样也会诱导缺氧诱导因子的表达。HepG2和Hep3B细胞培养在21％氧气的条件下，用不同浓度的氯化钴，如100μM、150μM、200μM处理24小时。结果显示TET1、TET2、TET3的表达显著升高，且随氯化钴浓度的增大而增加，表明在21％的氧气浓度下氯化钴也能诱导TET酶的表达。 2、在21％氧气条件下，HepG2和Hep3B细胞用150μM氯化钴处理不同时间，如8小时、16小时、24小时，结果显示16小时时TET1、TET2、TET3的表达显著升高，表明氯化钴确实可以诱导TET酶的表达。 3、用ShRNA剔除HepG2和Hep3B细胞内的缺氧诱导因子后，TET1、TET2、TET3的表达在1％氧气浓度条件下和在21％氧气浓度条件下没有明显差异，表明缺氧诱导TET酶的表达是依赖于缺氧诱导因子。 4、用ShRNA剔除HepG2和Hep3B细胞内的缺氧诱导因子后，在150μM氯化钴处理24小时，TET1、TET2、TET3的表达没有明显变化，表明氯化钴诱导TET酶的表达也是依赖于缺氧诱导因子。 5、TET酶的启动子含有缺氧诱导因子的结合序列，用萤光素酶报告基因检测法检测到在HepG2和Hep3B细胞，TET1启动子萤光素酶的表达在1％的氧气条件下明显高于21％的氧气条件。而当缺氧诱导因子的结合序列被突变，破环了缺氧诱导因子的结合时，萤光素酶的表达在1％的氧气条件下和在21％的氧气条件下没有明显变化，表明缺氧是通过缺氧诱导因子激活TET1启动子的表达。 综上所述，我们的研究表明缺氧能够诱导HepG2和Hep3B细胞TET酶的表达，升高5-羟基胞嘧啶的水平。和缺氧一样，氯化钴也能诱导TET酶的表达。缺氧和氯化钴引起的细胞内TET酶的升高是由缺氧诱导因子介导的。剔除细胞内缺氧诱导因子的表达或破坏缺氧诱导因子在TET酶启动子上的结合序列，可以阻止缺氧对TET酶的调节作用。