流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属,是流行性感冒(简称流感)的病原体。近年来,禽流感病毒H5N1和H7N9引起了数百例人感染[1],相对于季节性流感,禽流感病毒患者死亡率明显增高(分别达60%和36%)[2-4]禽流感病毒的高致病性与其能诱导诸如“细胞因子风暴”等过强机体免疫反应高度相关,但是其具体作用机理不清,且未能定位禽流感病毒中导致“细胞因子风暴”的具体致病因子。流感病毒HA蛋白为膜蛋白,位于病毒及感染细胞表面,存在与免疫细胞直接作用的可能,因此我们开展了流感病毒HA蛋白与免疫细胞的相互作用初步研究,为进一步研究HA蛋白与禽流感病毒致病性的关系打下基础。为在哺乳动物细胞上研究HA与免疫细胞的相互作用,我们首先利用PiggyBac转座子构建了可诱导性表达各型流感病毒HA蛋白的293A细胞系,流式检测结果显示收获细胞中约80～90%细胞均表达HA蛋白,提示PiggyBac转座子可以使各亚型流感病毒的HA基因高效而准确的插入到细胞基因组中。Westerning Blot结果显示各型流感病毒HA蛋白均表达成功,且随着Cumate诱导剂量的改变,诱导表达HA蛋白的量也发生相应改变。为观察流感病毒HA蛋白与免疫细胞的相互作用,我们观察了表达各亚型流感病毒HA蛋白的细胞系与PBMC中各细胞亚群的结合能力,结果显示表达各亚型流感病毒HA蛋白与不同免疫细胞具有不同的亲和力:(1)与表达H3N2HA蛋白的细胞系相比,表达H7N7和H7N9 HA蛋白的细胞系对CD4+T细胞和CD8+T细胞均具有明显的吸附作用,其中H7N9 HA细胞系主要吸附中央记忆性和初始CD4+T细胞,而H7N7HA细胞系对各型T细胞均有显著的亲和力;(2)表达H7N9HA蛋白的细胞系对B细胞具有明显的吸附作用,在其他各亚型细胞系中均未观察到该作用。为探讨H7 HA蛋白与免疫细胞结合的初步机理,我们观察了神经氨酸酶(NA)处理PBMC对其与H7 HA细胞系结合能力的影响,结果发现去除唾液酸可以完全阻断H7 HA对T细胞的亲和力。但是H7N9 HA细胞系对B细胞的吸附作用虽然减弱但仍然存在。提示唾液酸的存在对H7 HA与免疫细胞的结合具有显著影响。为定位H7 HA蛋白与免疫细胞相互结合的具体作用位点,我们以H3N2 HA蛋白为骨架,将其各功能节段替换为H7 HA1的同源相应节段,但是表达上述突变的细胞系均未表现出显著的与免疫细胞的亲和力,提示H7 HA与免疫细胞的结合可能为HA多部位协同作用,目前该部分正在进展中。为定位H7N9 HA蛋白与B细胞结合的关键作用位点,我们分析了 H7N9 HA1与H7N7 HA1氨基酸序列的差异,共观察到15个氨基酸残基差异。我们将H7N9 HA1上的氨基酸残基逐一突变为H7N7 HA1的相应氨基酸残基,并观察其对H7N9 HA与B细胞亲和力的影响。结果显示H7N9蛋白11号氨基酸突变体对B细胞的亲和力显著下降,但该突变HA蛋白对CD4+T细胞和CD8+T细胞仍然保持较高的亲和力,因此我们已成功定位到了 H7N9吸附B细胞的关键氨基酸。综上所述:各亚型流感病毒HA蛋白对不同免疫细胞具有不同的亲和力,与H3N2的HA蛋白相比,H7N7和H7N9的HA蛋白对T细胞均有强弱不等的吸附作用,但仅有H7N9的HA蛋白对B细胞具有很强的吸附作用。上述研究结果为深入研究H7N9禽流感病毒的致病机理提供了新线索。