研究背景胰腺癌是常见的恶性程度很高的消化道肿瘤之一,无论是国内还是国外,其发病率在近些年来有逐年上升的趋势。在美国,胰腺癌死亡病例数在各恶性肿瘤致死数中位居第4位,在中国,胰腺癌死亡率在各恶性肿瘤中排在第6位。由于胰腺癌起病较隐匿,缺乏特异的临床表现,恶性程度高,进展快,极易发生转移,不易早期诊断,多数患者就诊时已经处在晚期。手术根治切除是目前临床上治疗胰腺癌最有效的方式,但是多数患者在确诊时已经丧失了手术切除的机会,导致胰腺癌预后很差。因此深入探究胰腺癌发生发展的分子调控机制,寻找新的早期诊断标志物和潜在治疗靶点已成为胰腺癌研究领域的热点。目前认为肿瘤具有十大基本特征,即生长信号自给自足、抗生长信号不敏感、抵抗细胞死亡、无限的增殖潜能、诱导血管生成、组织浸润与转移、免疫逃逸、肿瘤相关性炎症、基因组不稳定与突变、细胞能量异常,而肿瘤相关性炎症被认为是肿瘤的第七大特征。越来越多的研究表明炎症与肿瘤的发生发展息息相关,炎症性疾病可以增加某些肿瘤的发病风险,非甾体抗炎药可降低多种肿瘤的发病率和死亡率,而在所有早期肿瘤及转移灶的微环境中可以检测到大量炎性细胞的聚集以及细胞因子和趋化因子的分泌,说明天然免疫与获得性免疫在肿瘤的发生发展中具有不可替代的作用。因此,我们希望从天然免疫的角度来阐述天然免疫中重要的分子在肿瘤的发生发展中发挥怎样的作用。模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)是机体对危险信号进行免疫识别并启动免疫应答的主要媒介,而Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族是近年来新发现的介导免疫应答的模式识别受体之一,TLRs的活化可以启动下游信号通路,调控天然免疫应答向获得性免疫应答的转变,在机体抵御外来病原微生物感染中发挥着重要作用,也是目前研究较为透彻的受体。作为TLRs的重要成员之一,TLR3的配体主要是dsRNA病毒和Poly I:C。在许多免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞)及某些非免疫细胞(如内皮细胞、上皮细胞和肿瘤细胞)中均有表达,当TLR3被dsRNA病毒或外源性Poly I:C活化后,可以激活下游信号通路。已有研究表明,TLR3的下游信号通路主要包括MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径。通过MyD88依赖信号通路途径可以诱导一些炎症细胞因子的表达,如IL-1、IL-6、TNF-α等,参与非特异免疫应答反应,同时通过MyD88非依赖信号通路途径诱导Ⅰ型干扰素等细胞因子表达,诱导DC细胞分化成熟,参与抗病毒反应。越来越多的证据显示,TLR3与肿瘤之间存在着重要的联系,在肿瘤方面具有双重作用。首先,大量研究表明TLR3可以促进肿瘤细胞的凋亡,如在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、头颈部鳞状细胞癌等肿瘤中,可以通过活化TLR3引起肿瘤细胞的凋亡。同时,TLR3的激活可以促进一些炎症因子及干扰素的分泌,增强树突状细胞、自然杀伤细胞以及巨噬细胞等免疫细胞的抗肿瘤效应。因此,TLR3激动剂被应用于某些类型肿瘤的免疫辅助治疗。TLR3除了具有抗肿瘤的作用,还具有一定的促肿瘤效应。有既往报道TLR3可通过增加肿瘤细胞的转移能力介导肿瘤的侵袭和转移。比如过表达的TLR3与口腔鳞状细胞癌神经周围转移紧密相关;宿主肺上皮细胞TLR3活化促进肿瘤向肺部转移。我们通过对胰腺癌原发肿瘤及淋巴结转移肿瘤组织进行转录组测序,发现TLR3在淋巴结转移灶中的表达升高。而且目前在胰腺癌研究领域,TLR3对胰腺癌发生、发展及转移的研究较少,对其作用机制更是尚不明确。因此我们希望通过探究TLR3在胰腺癌淋巴结转移中作用及作用机制,找到辅助胰腺癌诊断、提示预后的新指标。研究目的研究TLR3在胰腺癌及其淋巴结转移组织中的表达特征与临床意义,进一步探究TLR3促进胰腺癌淋巴结转移的分子机制,为胰腺癌的诊断、治疗与预后评估提供新的靶标。研究方法1.采用转录组测序技术,对收集的3例胰腺癌原发肿瘤组织及对应的淋巴结转移肿瘤组织中基因的表达情况进行检测。2.利用免疫组化技术对57例伴有淋巴结转移的胰腺癌患者原发肿瘤组织和淋巴结转移肿瘤组织中TLR3的表达进行对比研究,同时检测27例无淋巴结转移的胰腺癌患者原发肿瘤组织中TLR3的表达,并分析所有84例胰腺癌患者原发肿瘤组织中TLR3的表达与患者临床病理指标间的相关性。3.通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测人胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2中TLR3的表达情况。4.选取PANC-1细胞株作为研究对象,通过脂质体转染质粒(pUNO1-hTLR3-GFP)的方法在PANC-1细胞中过表达TLR3,利用Blasticidin S对细胞进行筛选,得到相对稳定的过表达细胞株PANC-1 TLR3,利用荧光显微镜与qRT-PCR检测PANC-1 TLR3过表达情况后,进行后续的体内体外实验。5.利用TLR3过表达细胞株进行体外细胞学实验,观察TLR3对于胰腺癌细胞生物学行为的影响。通过CCK-8细胞增殖实验,检测TLR3对胰腺癌增殖能力的影响,利用Transwell迁移侵袭实验,检测TLR3对于胰腺癌迁移侵袭能力的影响。6.将胰腺癌细胞注射进入裸鼠胰腺,构建胰腺癌原位种植模型,观察TLR3在体内对于胰腺癌增殖的影响;将胰腺癌细胞注射进入裸鼠脾脏,构建胰腺癌肝转移模型,观察TLR3在体内对于胰腺癌细胞转移能力的影响。7.利用qRT-PCR、Western blot等分子生物学技术检测TLR3过表达后胰腺癌细胞内一些信号通路中关键分子的变化,探讨TLR3影响胰腺癌细胞淋巴结转移能力的分子机制。研究结果1.转录组测序发现TLR3在胰腺癌淋巴结转移组织中的表达高于原发肿瘤。2.免疫组化结果显示,在57例伴有淋巴结转移的胰腺癌患者中,淋巴结转移肿瘤中TLR3的表达高于原发肿瘤(Wilcoxon符号秩和检验统计量Z=-2.668,P=0.008)。而在所有84例胰腺癌患者中,原发肿瘤组织中TLR3表达与肿瘤最大直径和淋巴结转移存在一定的相关性(分别为P=0.0383,P=0.0006),即与TLR3低表达患者相比,TLR3高表达的患者肿瘤相对较大,且更易发生淋巴结转移。3.Kaplan-Meier生存分析结果显示,原发肿瘤中TLR3高表达的胰腺癌患者中位生存时间(12个月)显著低于TLR3低表达胰腺癌患者(20个月)(χ~2=7.1114,P=0.0077),因此TLR3可以作为提示胰腺癌患者预后的一个指标,但是Cox回归分析表明尚不能认为TLR3的表达高低是影响胰腺癌预后的独立危险因素。4.体外细胞学实验结果显示,TLR3过表达的PANC-1细胞增殖能力增强,迁移能力显著升高,但侵袭能力未受明显影响。裸鼠原位种植模型结果表明,TLR3过表达组肿瘤明显大于对照组;裸鼠脾脏注射肝转移模型表明,与对照组相比,TLR3过表达后的PANC-1细胞转移至肝脏并形成克隆性生长的数量明显增加。5.细胞分子生物学实验发现,TLR3过表达后,PANC-1细胞与EMT相关的E-cadherin的表达下降,N-cadherin表达升高,β-catenin表达升高,CD44分子的表达也同样升高,说明TLR3可能是通过Wnt/β-catenin通路调控胰腺癌细胞发生EMT同时上调CD44的方式促进淋巴结转移。结论胰腺癌淋巴结转移肿瘤中TLR3的表达高于原发肿瘤。与原发肿瘤组织中TLR3低表达的患者相比,原发肿瘤组织中TLR3高表达的患者肿瘤直径相对较大,且与淋巴结转移相关,预后也相对较差,因此TLR3是反映患者病情和预后的有价值的指标。TLR3表达升高可以增强胰腺癌细胞的增殖能力,提高胰腺癌细胞的转移能力,而胰腺癌转移能力的增强主要是通过降低胰腺癌细胞E-cadherin的表达,诱导细胞发生上皮间质转化(EMT)来实现的,这一过程可能是由Wnt/β-catenin信号通路来调节的,同时TLR3可以上调CD44的表达,使得胰腺癌细胞更易向淋巴结转移。