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目的:肥胖可引起胰岛素抵抗、肝脏异位脂质沉积等代谢紊乱。巨噬细胞介导的慢性低烈度炎症反应在肥胖相关性代谢紊乱中起关键作用,但具体的调控机制仍不完全清楚。穹窿主体蛋白(major vault protein,MVP)是核糖核蛋白细胞穹窿体的主要构成部分。MVP可介导细胞的多药耐药性,参与多种信号转导与细胞凋亡。近年来研究还发现,MVP参与机体细菌病毒感染等免疫炎症反应。但在不同外环境的刺激下,MVP在炎症中的作用尚存争议,其具体角色需谨慎甄别。本项研究旨在探讨MVP在代谢性炎症中的作用和机制,为临床防治肥胖相关性代谢紊乱提供理论基础和潜在的干预靶点。方法:对野生型小鼠分别进行普通饮食(CD)和高脂饮食(HFD)喂养,检测肥胖情况下小鼠附睾脂肪(epi WAT)中MVP的表达变化和定位。收取不同身体质量指数(BMI)人群的腹部内脏脂肪,检测MVP的表达差异。给予全身性、髓细胞特异性MVP敲除小鼠及对照小鼠高脂饮食喂养,建立肥胖小鼠模型,每周监测小鼠体重和空腹血糖水平。通过葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测小鼠血浆中胰岛素的含量。通过葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素耐量实验(ITT),确定MVP缺失对小鼠葡萄糖耐受和胰岛素抵抗的影响。通过Western Blot检测小鼠附睾脂肪、肝脏和骨骼肌在胰岛素刺激下,胰岛素信号通路关键分子AKT的磷酸化激活的情况。造模结束后收取小鼠血浆、附睾白色脂肪组织、皮下白色脂肪组织(sub WAT)、肠系膜周围白色脂肪组织(m WAT)、肾周白色脂肪组织(peri WAT)、棕色脂肪(BAT)以及肝脏等,称重并检测血浆和肝脏中甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)等。通过H&E和油红O染色检测肝脏组织中脂质积聚情况。进一步,研究MVP缺失对小鼠在体炎症反应的影响。RT-q PCR检测多种脂肪组织、肝脏以及附睾脂肪组织F4/80~+巨噬细胞中炎症介质m RNA水平的变化,用ELISA方法检测小鼠血浆中炎性细胞因子的含量,用免疫组织化学和流式细胞术检测附睾脂肪组织中巨噬细胞的含量。通过体外细胞实验,观察MVP对巨噬细胞炎症反应与IKK-NF-k B炎症信号通路的影响。用NF-k B通路抑制剂处理细胞,确定MVP对炎症反应的作用是否依赖于NF-k B信号通路。采用免疫共沉淀(Co-IP)的实验方法,寻找与MVP直接作用的靶点分子,并研究MVP对该靶点分子的功能影响。进一步探究MVP与该靶点分子的相互作用模式并确定MVP调控该靶点分子活性的关键结构域。利用慢病毒感染过表达基因,确定MVP及其功能片段是否能够抑制巨噬细胞炎症反应。结果:在高脂饮食喂养的野生型雄性小鼠附睾脂肪及雌性小鼠性腺脂肪组织中,MVP表达明显高于普通饮食组。且MVP主要表达于巨噬细胞,在脂肪细胞中含量极低。在超重或者肥胖人群(BMI≥24)的内脏脂肪巨噬细胞中,MVP表达也明显上调。高脂饮食条件下,全身性和髓细胞特异性MVP缺失小鼠的体重增长及各部分脂肪组织重量明显高于各自对照小鼠。MVP基因缺失小鼠的空腹血糖和胰岛素含量明显增加。GTT和ITT结果显示,MVP缺失可加重小鼠胰岛素抵抗。脂代谢相关指标检测发现,MVP缺失引起小鼠血浆和肝脏中甘油三酯及总胆固醇含量明显增加。肝脏组织H&E和油红O染色显示MVP缺失的小鼠肝脏组织脂滴数量增加,肝脏脂肪变性加重。免疫组织化学和流式细胞术结果显示,MVP缺失促进了脂肪组织中巨噬细胞的浸润。MVP缺失使得小鼠脂肪组织和肝脏中炎症介质均有不同程度的增加,附睾脂肪组织F4/80~+巨噬细胞中炎症介质表达也明显增加。MVP缺失还能增加小鼠血浆中肿瘤坏死因子α(TNF-α)等含量。进一步的机制研究表明,MVP缺失促进了细菌脂多糖(LPS)诱导的TNF-α、趋化因子配体(CCL2)的表达释放增多以及NF-k B信号通路的激活。加入NF-k B通路抑制剂,能明显逆转MVP缺失引起巨噬细胞炎症因子释放增加的作用。免疫共沉淀结果显示,MVP与TNF受体相关因子6(TRAF6)相互作用。在MVP缺失的巨噬细胞中,TRAF6的泛素化活性明显增强。MVP缺失促进白介素1受体相关激酶(IRAK1)对TRAF6的招募,使TRAF6寡聚化增强。进一步分析MVP的活性位点,发现MVP的1-480、481-685和686-870氨基酸片段均能结合TRAF6,但只有MVP全长和含α螺旋结构域686-870片段能够抑制TRAF6的寡聚化和泛素化,并抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。结论:在肥胖的人群和小鼠脂肪组织巨噬细胞中MVP表达明显增高。全身性和髓细胞特异性MVP缺失可加剧高脂饮食引起的小鼠体重增加、胰岛素抵抗以及肝脏脂肪变性等代谢紊乱。MVP的上述作用可能与其拮抗炎症反应的特性相关。在巨噬细胞中,MVP通过结合TRAF6,减少TRAF6泛素化,从而抑制NF-k B信号通路,MVP-686-870片段在其中可能发挥关键作用。本课题研究结果显示,MVP可能是巨噬细胞IKK-NF-κB信号通路的负性调节器,具有拮抗代谢性炎症的作用,在干预代谢性疾病中具有潜在的应用价值。