阿片类镇痛药物是目前临床常用的镇痛药,具有强效镇痛作用。然而阿片类镇痛药在其发挥强大的镇痛作用同时,也会产生药物成瘾、耐受、呼吸抑制、便秘等副作用,这大大限制了其在临床上的使用。因此,如何使阿片类镇痛药在发挥镇痛作用的同时,尽可能减少其伴随的不良反应就成为人们重点研究的问题。阿片受体主要分为μ、δ、κ三种受体亚型,其中μ阿片受体(mu opioid receptor,MOR)是镇痛药物的主要作用靶点。其激活的主要过程是当阿片类药物激活MOR后,下游的G蛋白发生解离,使得环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,c AMP)被抑制,偶联的离子通道开放。激活后的受体会被激酶磷酸化,进而引起β-arrestin2的招募,受体内吞和下游信号通路的激活。目前已经发现许多蛋白参与MOR的调控,他们通过调节MOR的修饰或影响MOR的激活过程,或者影响MOR本身受体数量,来调控MOR的功能。实验室前期发现A20 binding inhibitor of NF-κB activation 1(ABIN-1)蛋白可以调控MOR的功能。在进一步的文献调研中,我们发现TNF alpha induced protein 3(A20)蛋白通常和ABIN-1蛋白共同在多个信号通路中发挥作用。目前研究表明A20主要在炎症相关信号通路中起到抑制炎症发生的作用,同时也与多种免疫疾病的发生密切相关。但是关于A20在中枢神经系统中发挥作用的研究目前还很少。最近有文献报道以A20为靶标的micro RNA可以影响MOR激动剂吗啡的镇痛和耐受,但其机制尚不明确。因此我们推测A20和ABIN-1蛋白一样也可以影响MOR的功能。综上,本课题旨在研究A20蛋白是否能影响MOR的功能,并对其可能的影响机制进行进一步的探索,从而为设计合成高效低毒的阿片类镇痛药提供理论基础和设计思路。研究目的:研究A20对于MOR功能的影响及其机制探究,为研究新型镇痛药奠定基础。研究方法:1.利用小鼠热板法甩尾法研究A20对吗啡镇痛、耐受的影响1.1小鼠热板法镇痛模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热板法镇痛模型比较小鼠痛反应时间反映吗啡镇痛程度的变化,评价A20对吗啡镇痛的影响。1.2小鼠热板法慢性耐受模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热板法慢性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡耐受的影响。1.3小鼠热甩尾法镇痛模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热甩尾法镇痛模型比较小鼠甩尾反应时间反映吗啡镇痛程度的变化,评价A20对吗啡镇痛的影响。1.4小鼠热甩尾法慢性耐受模型在小鼠脊髓过表达或敲减A20,通过热甩尾法慢性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡耐受的影响。1.5小鼠热板法急性耐受模型在小鼠脊髓过表达A20,通过热板法急性耐受模型比较小鼠吗啡镇痛作用的下降程度,评价A20对吗啡急性耐受的影响。2.A20对于MOR下游AC-c AMP-PKA通路和MOR S375磷酸化的影响2.1 A20对于MOR下游c AMP的影响在MOR-293T细胞中分别过表达、敲减、回转A20蛋白,通过LANCE c AMP Assay和Glo Sensor c AMP Assay检测MOR下游c AMP含量的变化,观察A20对MOR下游c AMP的影响。2.2 A20对于MOR下游Protein kinase A(PKA)重分布的影响在MOR-PKA-GFP-CHO细胞中过表达A20和A20 C103A突变体通过高内涵分析仪器分析荧光PKA在细胞中的重分布现象,观察A20对MOR下游PKA的影响。2.3 A20对MOR S375磷酸化的影响在MOR-CHO细胞中过表达或敲减A20,通过Western blot分析A20对于MOR激动剂引起的S375磷酸化程度的影响。3.A20通过抑制β-arrestin2招募上膜进而影响MOR的内吞机制增强MOR的功能3.1 A20与β-arrestin2相互作用3.1.1免疫共沉淀在293T细胞中过表达β-arrestin2和A20,通过免疫共沉淀检测A20和β-arrestin2的相互作用。3.1.2 His-Pull down在293T细胞中过表达A20蛋白,免疫共沉淀检测A20和His纯化的β-arrestin2相互作用。3.1.3 Nano Bit Assay在293T细胞中过表达带有荧光素酶片段的A20和β-arrestin2蛋白,通过检测体系化学发光的变化研究A20和β-arrestin2相互作用。3.1.4免疫荧光在293T细胞中转染连接不同颜色荧光蛋白的A20和β-arrestin2,通过观察荧光在细胞中的分布,研究A20和β-arrestin2相互作用。3.2 A20对β-arrestin2招募上膜的影响3.2.1高内涵分析在MOR-β-arrestin2-e GFP-CHO细胞中过表达A20,通过高内涵分析带有荧光的β-arrestin2上膜程度观察A20对β-arrestin2招募上膜的影响。3.2.2 Nano Bit Assay在293T细胞中过表达A20和带荧光素酶片段的MOR和β-arrestin2蛋白。通过检测体系化学发光的变化观察A20对β-arrestin2招募上膜的影响。3.3 A20对MOR受体内吞的影响3.3.1荧光抗体标记膜上MOR在SNAP-MOR-CHO细胞中过表达A20,用荧光抗体标记细胞膜上MOR,通过检测细胞荧光值的变化研究A20对MOR内吞的影响。3.3.2分离细胞膜蛋白在小鼠脊髓和SNAP-MOR-CHO细胞中分别过表达A20,分离细胞膜蛋白,通过检测膜上MOR含量的变化,观察A20对MOR内吞的影响。3.4敲减β-arrestin2对于A20功能的影响3.4.1β-arrestin2敲除小鼠在β-arrestin2敲除小鼠脊髓过表达A20蛋白,通过热板法测量吗啡镇痛效果,观察敲除β-arrestin2对A20功能的影响。3.4.2 Glo Sensor c AMP Assay在MOR-293T细胞中敲减β-arrestin2后再过表达A20,或过表达A20后再敲减β-arrestin2,通过Glo Sensor c AMP Assay观察敲减β-arrestin2对A20功能的影响。研究结果:1.A20增强吗啡镇痛,抑制急性耐受但不影响慢性耐受。1.1 A20增强吗啡镇痛作用热板法吗啡镇痛结果显示,过表达A20组小鼠镇痛率均显著高于对照组,A20可以增强吗啡的镇痛作用;敲减A20组小鼠镇痛百分率较对照组出现了一定程度的下降,表明敲减A20可以减弱吗啡的镇痛作用。1.2 A20不影响吗啡慢性耐受的形成热板法和热甩尾法结果显示,过表达或敲减A20后小鼠均形成了吗啡慢性耐受,表明A20对慢性耐受的形成没有影响。1.3 A20抑制吗啡急性耐受的形成热板法实验结果显示,给予大剂量吗啡后,小鼠形成了吗啡急性耐受,过表达A20组小鼠急性耐受程度小于对照组,表明A20可以抑制吗啡急性耐受的形成。2.A20增强MOR下游AC-c AMP-PKA信号通路,抑制S375磷酸化2.1 A20增强MOR对下游c AMP-PKA通路的抑制作用LANCE c AMP Assay和Glo Sensor c AMP Assay实验结果表明,过表达A20可增强MOR对下游c AMP的抑制,敲减A20减弱该抑制作用。PKA重分布实验结果表明,过表达A20可以增强MOR对下游PKA重分布的抑制作用,过表达A20 C103A突变体则无此作用。2.2 A20抑制MOR S375磷酸化实验结果显示,过表达A20后MOR S375磷酸化水平降低,敲减A20后MOR S375磷酸化水平上升。表明A20可以抑制MOR S375磷酸化。3.A20通过抑制β-arrestin2招募上膜进而影响MOR内吞的机制增强MOR的功能。3.1 A20与β-arrestin2存在相互作用免疫共沉淀和Nano Bit Assay实验结果表明,A20和β-arrestin2存在相互作用,并且在激动剂刺激的条件下相互作用进一步增强,免疫荧光实验结果表明在A20和β-arrestin2细胞中具有明显的共定位现象。3.2 A20抑制β-arrestin2招募上膜高内涵分析和Nano Bit Assay实验结果显示,过表达A20组β-arrestin2招募上膜程度明显小于对照组,说明A20可以抑制β-arrestin2招募上膜。3.3 A20抑制MOR内吞荧光抗体标记膜蛋白实验结果显示,过表达A20后,细胞膜表面的MOR数量相比对照组明显增加,说明A20抑制了MOR的内吞作用。3.4敲减β-arrestin2后A20不能影响MOR功能实验结果显示,在动物和细胞中敲减β-arrestin2后,A20都不能再增强MOR的功能。表明A20增强MOR功能需要β-arrestin2参与。研究结论:1.A20增强吗啡的镇痛作用,抑制吗啡急性耐受的形成,但不影响吗啡慢性耐受的形成。2.A20增强MOR由激动剂引起的对下游AC-c AMP-PKA信号通路的抑制作用。3.A20通过与β-arrestin2相互作用,抑制β-arrestin2招募上膜,进而抑制MOR的内吞,提高MOR膜上数量。4.A20需要通过β-arrestin2蛋白影响MOR的功能。