论文部分内容阅读
在植物生长发育的过程中,各类非生物胁迫以及生物胁迫,例如高盐、干旱、极端温度以及病原菌会对产量以及质量造成严重的影响。在长期抵御外部胁迫的过程中,植物体内进化出了多种复杂而有效的信号网络,以减少受到的损害并适应环境变化,其中,以钙离子(Ca2+)以及植物激素脱落酸（abscisic acid,ABA）为核心的信号通路在植株的生长发育以及胁迫响应方面发挥着重要的作用。研究发现,Ca2+与ABA参与植物多种非生物与生物胁迫响应以及生长发育过程。然而,由于涉及到的各类蛋白众多,包括激酶、转录因子在内的许多成员参与调控上述通路的分子机制仍不清楚,为分子育种等农业技术应用带来障碍。本研究以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料,分别对CPK（CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE）与CIPK（CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN-INTERACTING PROTEIN KINASE）家族的各一个成员利用实时荧光定量RT-PCR（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）检测了二者在多种逆境与激素处理下的时空表达谱,通过酵母双杂交、双分子荧光互补（biomolecular fluoresecent complementation,BiFC）以及免疫共沉淀（coimmunoprecipitation,Co-IP）等手段鉴定了底物转录因子蛋白,利用体外磷酸化试验确定了两个激酶对转录因子的磷酸化作用以及磷酸化位点,并使用双荧光素酶报告系统（dual luciferase reporter system,Dual-LUC）在烟草（Nicotiana benthamiana）中检测了磷酸化作用对转录活性的影响,之后使用qRT-PCR在拟南芥突变体与转基因过表达植株中进行了验证,同时也对相关突变体与过表达植株在胁迫处理下的表型进行了比较分析。通过一系列的试验,结果表明,CPK6的表达受ABA与脱水诱导。CPK6的T-DNA插入突变体在种子萌发与幼苗根伸长期间对ABA不敏感,相反,CPK6的过表达转基因株系则显示出敏感性。此外,过表达CPK6的转基因株系显示出耐旱性。对CPK6的互作蛋白研究发现,CPK6与ABA信号转导核心转录因子ABF3（ABA-RESPONSIVE ELEMENT-BINDING FACTOR 3）、ABI5（ABA INSENSITIVE5）以及AREB3（ABA-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN 3）有较强的互作,与ABF2/4的互作则较弱,并通过体内以及体外试验进行了验证。之后的体外磷酸化试验以及磷酸化质谱分析显示,CPK6能够磷酸化ABF3与ABI5,并通过定点突变转录因子蛋白的测试验证了磷酸化发生的位点。在烟草中进行的Dual-LUC以及在拟南芥相关株系中进行的qRT-PCR中对ABF3/ABI5靶基因的表达水平分析都显示CPK6的磷酸化能够增强其转录活性。后续对cpk6 abf3或cpk6 abi5双突变体在种子萌发与萌发后幼苗生长期间的表型分析显示CPK6与ABF3/ABI5在ABA信号通路中具有上下游的遗传关系。另外,本研究发现,CIPK26的功能缺失突变体在种子休眠早期对ABA敏感。进一步的研究显示CIPK26的表达受到多种胁迫的快速诱导。进一步的测试发现,cipk26-1突变体植株显示出耐旱性。通过CIPK26与ABF/AREB转录因子的互作分析发现,CIPK26能够与包括AREB3在内的多个ABF/AREB转录因子互作。对AREB3转录因子实施定点突变,并进行体外磷酸化分析,结果显示,CIPK26对AREB3的21位的Ser残基进行磷酸化。此外,AREB3中Ser21的磷酸化对于ABA诱导的转录激活是必需的。对cipk26与areb3突变体种子的萌发测试发现,AREB3可以促进种子的休眠,而CIPK26作用则相反。蛋白稳定性试验表明,ABA可以促进CIPK26与AREB3的泛素途径降解,同时,AREB3的Ser21位点的磷酸化与否对其稳定性有显著影响。后续的蛋白互作分析发现,AREB3与这两个E3泛素连接酶SKP1B与HOS1互作,可能由这两个E3泛素连接酶介导被降解。综上,本研究得出的试验证据表明,CPK6通过磷酸化ABF/AREB转录因子正调控ABA信号转导与植株的耐旱性,揭示了ABA信号转导中钙依赖性Ser/Thr蛋白激酶的进行磷酸化调控的分子机制。另外,对于CIPK26的研究显示,CIPK26的磷酸化激活了ABA诱导的AREB3的转录活性,而这一磷酸化修饰又促进了AREB3的降解,从而对种子休眠早期的ABA信号通路进行精细调控。