研究背景1987年,Johnstone等在研究网织红细胞的成熟过程中,通过羊网织红细胞体外培养的上清超速离心后,收集到一种直径60 nm的囊性小泡,其将这些纳米级的小囊泡即命名为exosomes。 exosomes由脂质双分子层、跨膜蛋白、1mRNAs和microRNAs组成,密度在1.13ug/ml到1.19g/ml之间,在电子显微镜下呈杯状。后续研究发现上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、抗原提呈细胞、肿瘤细胞、肝细胞、肠上皮细胞、血小板、等多种细胞都能释放exosomes o人体生理体液,包括血液、尿液、母乳、羊水、精液、唾液、关节滑液、胸腹水、肺泡冲洗液、等中也都存在exosoemso exosomes被释放到细胞外不仅仅是为了单纯地清除细胞内废弃的蛋白,它还参与了细胞间的通讯。其能够作为细胞间的载体,传递生物的生理和病理信息,参与了多种不同的生理及病理过程。不同细胞来源的exosomes含有不同的分子组成,也具有与其来源细胞相似或相同的生物学功能。同样,exosomes中细胞特异性蛋白的存在也可以反应其来源细胞及其功能。目前对exosomes的研究不仅仅在其功能方面,更是到实际的应用—即诊断和治疗方法方面的开发。鉴于exosomes含有大量的转运蛋白、mRNA、microRNA等生物信息,能调节免疫反应、血管新生、细胞增殖以及肿瘤细胞侵袭,其可以作为非常理想的生物标记物来源,有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用。目前也有不少关于对血液、尿液、唾液等exosomes勺研究发现了多种疾病的生物标记物,有望对指导疾病的早期与个体化治疗带来新的希望。2004年,Pisitkun等首先报道在尿液中发现并分离出exosomes。人体尿液中含有大量的exosomes,其可以由泌尿系统(包括肾脏、膀胱、前列腺)的所有上皮细胞释放进入尿液。尿液exosoems与其它类型的exosomes一样,携带大量来源细胞的信息,十分有利于探索特定细胞的生理功能与病理变化。通过蛋白组学等方法人们已经在分离出的正常人尿液exosomes中鉴定出超过1000种蛋白质。尿液相对于其它体液具有无创、大量的独特优点,对泌尿系统疾病的早期诊断生物标记物、治疗和监测的靶点以及疾病的发病机制等研究具有极大的意义。近年来的一些研究发现,尿液exosomes蛋白谱的变化可以反映某些特定的肾脏病变情况。Exosomes可以携带信息穿梭于肾脏细胞之间,改变受体细胞蛋白谱与功能,这可能代表着一种肾单位内细胞与细胞间的信号传递机制。近年来结合尿exosomes分离技术及先进的蛋白质组学技术已经检测出不少肾脏结构与功能损害相关的尿exosomes生物标记物。尿液exosomes的发现对糖尿病肾病发病机制、早期诊断和监测标记物的研究带来了新的方向。最近(2014年)Zubiri I等发表在《J Protromics》上的论文报道其在对糖尿病肾病患者尿液exosomes质谱分析结果,其首先比较了两种目前常用的尿液exosomes分离富集方法,然后选择较适宜的方法进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。结果显示AMBP、MLL3、 VDAC1这三种蛋白在糖尿病肾病与正常组尿液exsomes中表达差异,可以作为糖尿病肾病早期诊断的备选生物标记物。除上述研究外,还有尿exosomes用于急性肾损伤、多囊肾、肾脏纤维化、膀胱癌等疾病的报道。尿液exosomes给肾脏病等泌尿系统疾病的研究带来了极大的前景,但日前还处于初期阶段,很多研究中面临的问题与挑战有待解决。首当其冲的就是尿液exosomes的分离、富集和纯化问题。到目前为止还没有统一的得到一致认可的标准方法。目前国际上主要使用的分离、富集方法有两大类：一种以超速离心为基础,第二种方法是以纳米膜离心超滤为基础,但这两种主要的方法均有缺点。另外目前所有尿液exosomes富集与纯化过程中而临的另外一个非常棘手的问题就是正常人尿液中大量存在的Tamm-Horsfall蛋白(THP)的干扰。THP在尿液中聚合成几微米长的双螺旋绳索样结构,将很多exsomes包裹其中,在分离exosomes时这些THP蛋白同时沉淀下来,从而会影响后续的exosomes蛋白质组学分析。目前尚无研究报道可以在exosomes中完全消除THP等外部蛋白的干扰从而使尿exosoems得到完全的纯化。缺乏尿液exosomes相关检测指标(如内部某种蛋白生物标记物)的标准化方法也是影响后续临床应用的一个问题。不同尿液标本稀释程度的差异决定了不能直接以实际测得的尿液exosomes相关指标来作正常与异常的比较。临床上目前应用尿肌酐来校正尿白蛋白浓度的方法欠准确,而应用exosomes本身的标记物蛋白如TSG101或者Alix蛋白来校正的方法又比较复杂,过程较慢。因此有必要寻求一种较简单、实用的exosomes相关标准化指标。本研究团队经过两年的前期研究创立了一种新的exosomes分离、富集方法-“液压透析法(hydrostatic dialysis)’’。该方法具有设备简单、成本低、处理量大,尿液中干扰性的可溶性蛋白有效清除,排除个体间exosomes外其它因素差异对后续生物学分析的影响(如不同尿液来源的酸碱程度差异在本方法处理后处在同一PH水平),最大程度减少了exosomes的损失,而且可以与超速离心、超滤方法上述两种分离、富集方法相结合用于不同目的的研究等主要优点。该方法在大规模推广应用前需要进一步通过中国人群不同肾病程度的尿液标本来验证该方法的可重复性与有效性。另外我们将在此方法分离、富集尿液exosomes基础上探讨可作为尿液exosomes成分标准化的候选指标。同时,进一步应用还原、烷基化、Trypsin酶解等方法探索对尿液exosomes的完全纯化(即完全清除exosomes外的干扰蛋白)。在纯化的尿液exosomes基础上,通过质谱分析了解尿液exosomes内部蛋白指纹图谱。方法1.尿液标本的选取与收集“液压透析法”验证研究标本从-80℃超低温冰箱所保存的中国人群尿液样本库中选取,包括正常人群组、前驱糖尿病组、糖尿病无蛋白尿组、糖尿病微量白蛋白尿组、糖尿病大量蛋白尿组尿液样本。标准化、纯化及质谱分析研究选取都柏林城市大学健康志愿者提供的尿液标本。所有入组对象均签署经都柏林城市大学国家生物传感器中心伦理委员会批准的知情同意书。收集研究对象晨起第一次尿液样本,不添加蛋白酶抑制剂及防腐剂,2小时内送实验室处理。2.“液压透析法”尿exosomes的分离、富集尿液标本先室温下2000g离心30分钟,除去细胞、细胞碎片、及部分Tamm-Horsfall蛋白。一上清液通过自行设计的液压透析装置进行exosomes分离、富集：检查装置连接良好后,将尿液标本倒入该装置,待样品浓缩至6-8ml时,加入200ml miliQ水,冲洗1000KD透析膜。待样品进一步浓缩至6-8ml时收集1000KD透析膜内的液体(↑1000KDa fraction).3.尿exosomes的鉴定透射电子显微镜观察“液压透析法”分离、富集的1、1000KDa部分液体中是否存在囊泡,囊泡的形状、大小。通过western blot检测尿exosomes自身的标记物TSG1O1。4.探讨尿液exosomes相关标准化(量化)指标探讨Tamm-Horsfall蛋白以及白蛋白这两种指标在尿液exosomes相关检测结果标准化的应用可行性。10位健康人尿液“液压透析法”富集的尿液exosomes样品(↑1000KDa),通过western blot技术在同一块膜上检测Tamm-Horsfall 蛋白与TSG101蛋白荧光信号以及白蛋白与TSG101蛋白荧光信号,利用Odyssey扫描系统自带的软件定量分析荧光信号强度。使用SPSS 13.0统计软件包对10份样品的灰度值数据进行统计分析。应用Spearman秩相关系数来分析THP与TSG101灰度值,以及Albumin与TSGIO1灰度值之间的相关关系,以p<0.05为差异有统计学意义。5.还原与烷基化反应对尿液exosomes外部干扰蛋白的去除Tamm-Horsfall蛋白的多聚体结构中富含二硫键。利用还原与烷基化试剂对二硫键破坏,观察其对尿液exosoems外部干扰蛋白(特别是Tamm-Horsfall蛋白的降解与清除情况)以及对exosomes的影响,为exosomes的纯化研究提供指导。6. Trypsin酶解反应对尿液exosomes外部干扰蛋白的去除及exosomes的纯化对尿液“液压透析法”富集的尿液exosomes样品(↑1000KDa)进行还原、烷基化及蛋白酶Trypsin酶解反应。将外部的蛋白(特别是Tamm-Horsfall蛋白)分解成肽段,再经过截留分子量为30KD的超滤装置进行分离。利用凝胶考马斯亮蓝染色、western blot及透射电镜观察Tamm-Horsfall蛋白的分解及清除情况,以及对exosomes本身的影响。7.在尿液exosomes纯化的基础上对exosomes内部蛋白指纹图谱的分析对尿液“液压透析法”富集的尿液exosomes样品,利用上述方法进行exosomes纯化。然后使用去污剂脱氧胆酸钠破坏exosomes外膜,暴露exosomes内部成分,再进行还原、烷基化及Trypsin酶解蛋白,利用质谱分析了解exosomes内部蛋白指纹图谱。结果1.新型尿液exosomes分离、富集技术的验证中国人群不同肾脏病变程度尿液样品通过“液压透析法”均可有效分离、富集exosomes,体现了很好的重复性和稳定性。透射电镜下可以观察到↑1OOOKDa样品中散在分布的大小不等的囊泡,囊泡主要的直径范围为40-1 OOnrn,最小的囊泡直径为20-30nm,最大的囊泡直径可为400nm 。 Western blot检测到exosomes自身的标记物TSG101阳性,表明尿exosomes富集过程中exosomes未受到破坏。2.尿液exosomes相关标准化(量化)指标通过Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描后的图像通过Quantity-One图像分析软件扫描计算出条带平均灰度值。Spearman秩相关系数的分析结果显示Tamm-Horsfall蛋白与TSG101荧光强度相关系数r=0.842,p=0.002,两者之间具有正相关关系。3.还原与烷基化反应对尿液exosomes外部干扰蛋白的去除凝胶考马斯亮蓝染色及western blot结果显示,还原与烷基化反应后exosomes外Tamm-Horsfall蛋白部分降解,但两种还原及烷基化试剂在不同速度离心下均不能完全消除Tamm-Horsfall蛋白对exosomes的影响。4.Trysin酶解反应对尿液exosomes外部干扰蛋白的去除及exosomes的纯化凝胶考马斯亮蓝染色及western blot结果显示,还原、烷基化基础上的Trypsin酶解反应,可将exosomes外Tamm-Horsfall蛋白完全降解。通过截留分子量为30KD的超滤装置可清除已降解的肽段,实现exosomes的纯化。整个过程中exosomes未受到破环。5.在尿液exosomes纯化的基础上对exosomes内部蛋白指纹图谱的分析在上述纯化的exosomes的基础上,对exosomes内部成分进行MS/MS分析,结果共鉴定出exosomes内部942种蛋白质并对鉴定的蛋白进行了细胞组分、分子功能与生物过程的分析。结论1.本研究团队所发明的“液压透析法”能够很好地分离、富集尿液中的exosomes有着良好的重复性和稳定性,适用于不同的实验室、不同的人群以及不同的尿液病理状态,是一种值得广泛推广应用的技术方法。2.Tamm-Horsfall蛋白可以作为检测尿液exosomes相关生物标记物的候选标准化(量化)指标。3.应用还原、烷基化及Trypsin酶解反应结合超滤装置能实现尿液exosomes的纯化,再此基础上鉴定可靠的exosomes内部蛋白质图谱。4.本研究建立了一套从尿液收集,到尿液exosomes分离、富集、纯化及蛋白质组学分析的一体化研究方法,为后续的疾病尿液exosomes生物标记物研究提供了指导。