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研究背景急性呼吸窘迫综合征ARDS(acute respiratory distress syndrome)是由过度炎症引起的一种急性、弥漫性肺损伤,主要临床表现为低氧血症、急性或进展性呼吸困难和非心源性肺水肿。4年前制定的国际新标准已取消了ALI/ARDS的概念,而把此病统一称作ARDS。作为一种死亡率居高不下的临床危重症疾病,该病的预防和治疗研究一直备受重视。近年来,虽然在药物疗法、保护性机械通气以及气道管理等方面取得了一些进展,但因其发病机制仍未完全明确,疾病的最终治疗效果并无显著改善。氧化应激被认为是肺部过度炎症发生和发展的关联机制,由其所介导的组织损伤是ARDS病变过程中的重要事件,而肺组织中的中性粒细胞和巨噬细胞是ARDS时肺内活性氧ROS(Reactiveoxygenspecies)产生的最主要来源。胍丁胺(agmatine,AGM)是由精氨酸脱羧形成的生物胺,经前期研究证实,在脂多糖(LPS)引导的小鼠急性呼吸窘迫综合征实验中,胍丁胺可以发挥抗炎效应并显著提高生存率。在此基础上,本项目围绕―胍丁胺可能通过调控巨噬细胞过度氧化反应从而在内毒素性肺损伤中发挥保护作用‖的设想,研究胍丁胺对LPS所致大鼠ARDS的保护作用,以PI3K/Akt、Nrf2/HO-1信号通路为对象,研究胍丁胺影响巨噬细胞ROS生成的信号转导机制,并进一步明确了HO-1终产物胆红素(bilirubin)是否参与胍丁胺的抗氧化功能。旨在明确胍丁胺针对内毒素肺损伤所发挥治疗和保护效应的机理,同时为深入认识体内内源性生物胺参与外周抗炎作用与调控机制提供新的理论基础,为探寻利用机体自身生物学物质、改善ARDS治疗提供新思路。材料与方法(1)胍丁胺对LPS诱导的大鼠ARDS的治疗保护作用采用气管内注射法给药建模。将100只雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组、LPS组、AGM治疗组和AGM组,每组25只。第一次给药:对照组给予生理盐水0.1ml,LPS组给予3mg/kg LPS 0.1ml,AGM治疗组给予3mg/kg LPS 0.1ml,AGM组给予5mg/kg AGM 0.1ml;30分钟后第二次给药:对照组、LPS组和AGM组皆给予生理盐水0.1ml,AGM治疗组给予5mg/kg AGM 0.1ml。每组随机选取10只,通过观察4日存活率来评估AGM对LPS诱导的急性呼吸窘迫综合征大鼠的治疗保护作用。每组随机抽取5只动物行鼠尾静脉荧光标记物注射。其余动物于给药后24小时处死采集肺组织标本。通过比较肺泡灌洗液(BALF)和肺组织中炎症因子表达水平以及中性粒细胞MPO水平来评估肺部炎症变化情况;采用肺湿/干测定以及FITC-BSA荧光标记法来评估通透性改变;通过肺组织HE染色观察组织损伤改变;通过检测肺组织抗氧化酶SOD活性和脂质氧化(MDA)含量以及Western blot方法检测HO-1表达来评估氧化应激水平的变化。(2)以RAW264.7细胞为模型探讨AGM在LPS诱导的过度氧化反应中的抗氧化作用MTT法检测存活率并选择适合的给药浓度。采用治疗性给药使胍丁胺作用于经LPS刺激活化的RAW264.7细胞,在不同时间点收集细胞培养上清和细胞蛋白。化学比色法检测SOD活性与MDA含量;Griess法检测细胞培养基中NO的表达;采用DCFH-DA荧光探针标记活细胞测量其生成ROS的状况;Western Blot检测细胞中i NOS蛋白的含量。(3)AGM在LPS诱导活化的RAW264.7细胞中抗氧化作用的机制研究采用实时定量PCR方法检测α2肾上腺素能受体(α2-adrenoceptor)和咪唑啉受体(imidazoline receptor)I1R、I2R在AGM抗氧化调节中对HO-1表达的影响;用Western blot法检测总AKt和磷酸化AKt的变化,观察AKt抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路后,PI3K/Akt下游Nrf2活性和HO-1m RNA表达的变化以及ROS生成的情况;用WB方法测定转录因子Nrf2在胞浆和胞核内的表达情况,结合EMSA测定入核的Nrf2的DNA结合力;利用Zn PP阻断HO-1通路,明确AGM的抗氧化功能与Nrf2/HO-1信号通路的密切程度;并通过胍丁胺量效测定HO-1催化终产物胆红素(bilirubin)的变化以及对NO生成的影响,明确HO-1催化终产物与AGM的抗氧化作用的关系。结果(1)治疗性地由气管内给予AGM使ARDS模型大鼠4日存活率显著上升(P<0.05);AGM治疗组BALF与组织中TNF-α和IL6含量明显减少;肺泡网状结构损伤减轻,肺湿/干、MPO活性、MDA含量皆显著下降,FITC标记的荧光蛋白进入肺内的量明显降低;肺内SOD活性和HO-1表达水平显著增加(P<0.05)。(2)LPS刺激导致RAW264.7细胞i NOS蛋白的含量升高,ROS和NO大量生成,给予AGM治疗可显著缓解LPS所致ROS和NO生成(P<0.05),提高SOD活性。(3)与LPS组相比,AGM治疗可以增强细胞内AKt磷酸化水平,Nrf2入核明显增加,核内Nrf2的DNA结合活力明显增强,HO-1表达显著提高,ROS生成明显降低(P<0.05);LY294002和Zn PP都可以消除AGM对ROS的缓解作用;HO-1的催化终产物与AGM呈剂量依赖性变化;应用相应阻断剂阻断α2肾上腺素能和咪唑啉I1R、I2R不影响AGM所致HO-1水平变化。结论(1)胍丁胺能够缓解LPS所致大鼠肺水肿,改善通透性,减轻过度炎症,提高生存率,对ARDS具有治疗保护效应。(2)胍丁胺能够减轻巨噬细胞炎症因子释放,增强抗氧化酶SOD活性,降低ROS和NO生成,表明胍丁胺可以调控巨噬细胞抗炎、抗氧化功能发挥治疗效应。(3)PI3K/Akt、Nrf2/HO-1途径以及HO-1催化终产物皆参与了AGM对LPS诱导的过度氧化反应的调节作用。