论文部分内容阅读
目的：TPX2(targeting protein for Xklp2)是一个严格受细胞周期调控的核增殖蛋白，对细胞有丝分裂纺锤体的稳定具有重要作用。体内外实验均表明TPX2过表达导致细胞中心体的异常扩增及异倍体形成，进而促进细胞增殖、诱导凋亡、参与细胞周期调节，并与肿瘤分化、转移和复发明显相关。本实验研究针对靶基因TPX2的特异性小干扰RNA(small RNAinterference, siRNA)对宫颈癌Hela细胞株TPX2基因和蛋白表达的抑制作用，为宫颈癌的靶向基因治疗提供了实验基础和理论依据。方法：以宫颈癌Hela细胞为研究对象，按照siRNA的设计原则设计4对针对TPX2基因的siRNA（分别命名TPX2-siRNA-1、TPX2-siRNA-2、TPX2-siRNA-3和TPX2-siRNA-4）和１对不针对任何靶基因的非特异性阴性对照siRNA（命名为TPX2-siRNA-Neg）。MTT法分别检测Lipofectamine2000和阴性siRNA两种转染试剂的细胞毒性，根据细胞毒性试验结果，将Lipofectamine2000和阴性siRNA以不同配比转染Hela细胞，转染后4h和24h分别应用流式细胞仪和荧光显微镜评估转染率，从而筛选出最佳转染条件。利用Lipofectamine2000脂质体法将设计合成的TPX2-siRNA转染入宫颈癌Hela细胞中进行后续实验，观察siRNA沉默TPX2基因的效果和蛋白表达的抑制情况。本实验共分6组：Hela空白对照组、TPX2-siRNA-1、TPX2-siRNA-2、TPX2-siRNA-3、TPX2-siRNA-4及阴性对照组（TPX2-siRNA-Neg）。转染24小时后提取各组细胞总RNA，以RT-PCR方法检测转染后Hela细胞株TPX2mRNA的变化。转染48小时后提取各组细胞的总蛋白，以Western Blotting法检测转染后TPX2蛋白表达情况，计算蛋白表达抑制率。采用SPSS13.0软件对实验结果进行统计分析。统计数据以均数±标准差来表示，t检验和方差分析用来比较两样本及多样本分析，显著性差异水平为α=0.05。结果：1、阴性siRNA分别以0.25μl、0.5μl、0.75μl、1μl、1.25μl及1.5μl的用量转染1×104个Hela细胞后其细胞存活率均在95%上，随着时间的延长，在转染24h、48h、72h及96h后细胞存活率无统计学意义（P>0.05）。Lipofectamine2000以1.25μl和1.5μl转染1×10~4个Hela细胞24h后细胞存活率分别为90.32%和89.39%，且随时间的延长细胞存活率随之降低，与0.25μl、0.5μl、0.75μl及1μl组相比具有统计学意义（P<0.05）。2、在siRNA浓度为20μmol/L、siRNA与Lipofectamine2000以2.5:2配比转染Hela细胞时其转染效率最高，24h转染率为（98.33±1.53）%。3、实验组4种TPX2-siRNA转染后均发挥TPX2基因沉默效应，尤以TPX2-siRNA-4效果最明显，其TPX2的相对含量为0.089±0.008与空白对照组0.507±0.056及阴性对照组0.463±0.115相比有统计学意义（P<0.05），TPX2基因沉默效率为（82.5±0.43）%。4、 TPX2-siRNA-4的蛋白表达水平明显降低，蛋白相对含量为0.298±0.072，与空白对照组0.814±0.085及阴性对照组0.809±0.055相比均有统计学意义（P<0.05），TPX2蛋白抑制率达（63.4±1.05）%。结论：TPX2-siRNA成功转染入宫颈癌Hela细胞后能特异性诱导TPX2基因mRNA的降解，抑制TPX2蛋白水平的表达，这为进一步研究其对Hela细胞生物学特性的影响奠定了基础。