咖啡酸酯类和酰胺类化合物普遍存在于自然界植物组织中，具有很高的生物活性，例如抗氧化、抑菌和抗癌性等，手性咖啡酸化合物的生物活性也已经有文献报道。咖啡酸酯类和酰胺类化合物的合成方法，有生物提取、化学合成和生物催化三种，但是对于手性咖啡酸化合物的合成方法，目前尚没有报道。本文首次选用Novozym435（CandidaAntarctica lipase，CAL-B）作为催化剂，成功合成了系列手性咖啡酸酯类和酰胺类化合物，同时对酶催化不对称合成的反应条件进行优化，并通过酶催化动力学和热力学研究对酶催化的选择性机制进行研究。又考虑到实验中所使用的商品酶高成本，本文构建了含有CAL-B目的基因的重组质粒PA1K-pPIC9K，转入毕赤酵母GS115中，获得含有目的基因的表达菌，甲醇诱导表达后，获得可溶表达的目的蛋白CAL-B，并对表达条件进行了优化。一、咖啡酸2-戊酯的催化合成利用脂肪酶Novozym435催化咖啡酸和过量的(R,S)-2-戊醇合成(R)-咖啡酸2-戊酯。此外我们还初步优化了反应的最佳条件：溶剂为无水异辛烷，底物摩尔比咖啡酸/(R,S)-2-戊醇为1/20，酶用量为70mg/ml，在70℃条件下反应进行72h，最终反应转化率为20%，对映体过量值e.e.P为98%。随后，我们研究了脂肪醇碳链长度对反应的影响，发现随着碳链的延长，反应的转化率逐渐地降低，但是对映体选择性会升高。最后对固定化酶进行了重复利用实验，结果显示，酶在重复使用5次后，没有明显的酶催化活性和对映体选择性的降低。实验的最后，对反应热力学和动力学的研究表明，此反应受焓驱动，而E-value由次级反应常数Kcat/Km决定。二、咖啡酸2-戊酯合成条件的响应曲面优化在前一章实验条件优化的基础上，进行了响应曲面法（RSM）优化实验，利用软件Design-Expert7.0设计了5水平4因素实验，通过分析后，预测出了最佳的反应条件：反应温度67℃，底物摩尔比1:21，反应时间52h，酶用量50.8mg，以此最佳条件，预测的响应结果为转化率31%，e.e.P为99%。随后在预测的最佳实验条件下进行了3次重复实验，实验结果的e.e.P都为99%，转化率分别为34.3%、35.2%和31.9%，与预测的实验结果基本一致。三、咖啡酸2-苯乙酰胺的催化合成通过肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸和咖啡酸的比较，证明了咖啡酸苯环上3C′、4C′位的羟基对酶催化的酰化反应有抑制作用，此外，本文发现咖啡酸MOM酯比甲酯更有利于酰化反应的进行。在此基础上，本文设计新型酶催化不对称合成路线制备手性咖啡酸酰胺化合物，具体研究步骤如下：首先，利用MOM-Cl将咖啡酸的羟基和羧基同时保护，得到MOM保护的咖啡酸MOM酯，然后用Novozym435催化该酯和(R,S)-ɑ-苯乙胺反应，成功地合成了R构型的MOM保护的咖啡酸2-苯乙酰胺，再将催化产物进行脱MOM得到最终产物(R)-咖啡酸2-苯乙酰胺。经过筛选，得到酶催化不对称合成的最佳条件为：反应溶剂为无水异辛烷，应时间24h，反应温度70℃、底物摩尔比1：40和酶用量40mg。最终的反应转化率为25.5%，对映体过量值e.e.P大于99%，酶对映选择性E-value大于100。最后对固定化酶进行了重复利用实验，结果显示，酶在重复使用5次后，没有明显的催化活性和对映体选择性的降低。实验中，对反应热力学和动力学的研究同样表明此反应受焓驱动，而E-value由次级反应常数Kcat/Km决定四、CAL-B在毕赤酵母中的表达与纯化将实验室中已经成功构建的含有目的基因CAL-B的重组质粒PA1K-pPIC9K线性化之后，通过电转化方法转入毕赤酵母GS115中，经过对重组子的筛选后，得到阳性重组菌。利用阳性克隆菌的基因组进行PCR鉴定，证明我们得到了含有目的基因的重组菌。将重组菌进行诱导表达，得到目的蛋白CAL-B，经过硫酸铵沉淀、DEAE离子交换层析和G-75凝胶层析等纯化步骤后之后，得到了电泳纯的目的蛋白，我们还对诱导条件进行了初步的优化，得到的最佳诱导条件为：甲醇添加量1%、发酵密度12%、发酵液pH值为6.0。最终每升发酵液可得到90mg蛋白，比活力为376U/mg，酶总活力收率为38%。本文中，不仅成功建立了酶催化不对称合成咖啡酸衍生物的方法，更为其它手性酸类衍生物的制备提供新的研究思路。