鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）引起的，该病主要发生在1-8周龄的鸭，尤其是2-3周龄的雏鸭最易感。本病主要以纤维素性心包炎，肝周炎，气囊炎或脑膜炎等为临床症状，是目前危害养鸭业最为严重的细菌性传染病之一。当前已报道的RA血清型有21种之多，各个血清型之间缺乏有效的交叉保护，使用疫苗免疫预防此病比较困难。鸭疫里氏杆菌在侵入宿主后，繁殖迅速，并经血液到达全身组织器官，引起全身多发性浆膜炎。而目前对鸭疫里氏杆菌如何在宿主体内定植并逃避宿主的免疫系统，引起宿主发病的分子机制尚不清楚。因此，利用分子生物学手段，探究鸭疫里氏杆菌的致病机理及免疫机制显得尤为重要。　　CRISPR-Cas系统是在原核生物中发现的一种专门针对噬菌体及质粒等外源基因的获得性免疫系统，由一个成簇有序间隔短回文重复序列(CRISPR)和相关蛋白家族(Cas)组成，广泛分布于真菌和古细菌中。近年来，随着对CRISPR-Cas系统研究的增多，人们对 CRISPR-Cas系统的认识也愈加深入。最近研究发现， CRISPR-Cas系统可以帮助细菌逃避宿主的免疫系统，它不仅能帮助细菌抵抗外源核酸入侵，而且其相关Cas基因还与细菌的毒力相关。经生物信息学分析，在鸭疫里氏杆菌中存在II-C型 CRISPR-Cas系统，本研究通过构建Cas基因缺失株，初步探讨鸭疫里氏杆菌的致病机理，进而为相关疫苗的开发提供理论基础。本研究获得的结果如下：　　1、鸭疫里氏杆菌RA-YM Cas基因缺失株的构建　　利用PCR分别扩增Cas9、Cas1基因的左右同源臂（L、R）及壮观霉素基因（S），采用Overlap PCR的方法将三个基因片段串联。然后将串联的L、S、R三个片段连接到自杀性质粒 pRE-112上，构建重组自杀性质粒 pRE-LSR。将构建成功的pRE-LSR转化至E.coli X7213中，作为供体菌，以RA-YM（鸭疫里氏杆菌云梦株）作为受体菌，采用接合转移的方法分别构建RA-YM Cas9、RA-YM Cas1基因缺失突变株。在含壮观霉素的平板上，挑取单菌落，连续传代5次后，发现候选菌株可以稳定传代。　　2、鸭疫里氏杆菌RA-YM Cas基因缺失株与亲本株生物学特性比较　　比较RA-YM Cas9、Cas1基因缺失突变株与亲本株RA-YM的生长特性和生化特性，结果显示Cas9基因突变株与RA-YM亲本株在体外液体培养基中的生长速度没有显著性差异，Cas9基因突变株的生化特性与亲本株相比也没有发生改变；Cas1基因缺失株在体外液体培养基中的生长速度比亲本株要快，且差异显著，而生化特性与亲本株一致。　　3、鸭疫里氏杆菌RA-YM Cas基因缺失突变株对雏鸭致病性的研究　　对12日龄樱桃谷肉鸭进行攻毒实验，结果显示Cas9基因缺失株与野生株相比毒力下降了约317倍，Cas1基因缺失株与野生株相比毒力下降了约59倍。比较RA-YM Cas9、RA-YM Cas1基因缺失突变株与亲本株RA-YM在血液和组织中的载菌量，结果显示Cas9基因缺失突变株与亲本株RA-YM在脑组织中的载菌量无显著性差异，而在心脏、肝脏组织及血液中的载菌量有显著性差异。Cas1基因突变株在心、肝、脑、脾及血液中的载菌量与亲本株RA-YM相比没有显著性差异。　　4、鸭疫里氏杆菌RA-YM Cas9基因缺失突变株转录组测序分析　　在体外液体培养条件下，通过对RA-YM和RA-YMΔCas9菌株进行转录组测序，分析差异表达基因。分析结果显示，RA-YM Cas9基因缺失株与亲本株RA-YM相比表达差异在2倍或2倍以上的基因共500个，其中表达上调的基因有336个，表达下调基因的有164个。将RA-YM和RA-YMΔCas9菌株差异表达的500个基因进行GO聚类分析，发现这些基因主要与代谢、膜成分、结合蛋白、转运活性及催化活性等相关。　　5、鸭疫里氏杆菌RA-YM Cas9基因缺失突变株对雏鸭免疫保护效果的研究　　用Cas9基因缺失株对7日龄樱桃谷肉鸭通过分别滴鼻和皮下途径进行免疫，免疫后14d，通过脚蹼注射4.2×106CFU野生型鸭疫里氏杆菌YM株进行攻毒。结果显示当采用3.0×105 CFU/只的菌量，经滴鼻途径免疫后，RA-YM Cas9基因缺失突变株对雏鸭的保护率可达到80%，而经皮下注射的途径免疫后其免疫保护率仅为30%。