Runx3的免疫调节作用及其与胃癌关系的研究

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目的分析胃癌患者Runx3基因的表达水平以及和Th1细胞亚类特异性转录因子、细胞因子基因表达的相关性,从转录水平研究Runx3基因与胃癌的关系;克隆并鉴定人Runx3基因;构建原核表达载体并在体外表达Runx3蛋白;构建Runx3真核表达载体并转染胃癌细胞系SGC-7901,初步探索了Runx3参与的胃癌生物治疗的可行性。方法(1)采用RT-PCR,Real-time PCR,精确测定100例胃癌患者及50例健康人外周血单个核细胞(PBMC)中Runx3、T-bet转录因子和IFN-γ细胞因子的水平。(2)利用RT-PCR方法,从健康人外周血中分离得到的淋巴细胞mRNA,逆转录cDNA,PCR扩增获得人Runx3基因;将Runx3基因克隆至pMD19-T载体,进行单、双酶切鉴定及序列分析。(3)将Runx3基因克隆到pQE30原核表达载体,在大肠埃希菌M15中表达,获得带有His标签的43KD左右的Runx3融合蛋白;利用Bio-Rad公司的IMAC柱纯化Runx3蛋白;用抗-His抗体对Runx3融合蛋白进行westernblot鉴定。(4)将Runx3基因克隆到pIRES2-eGFP真核表达载体,将重组质粒pIRES2-Runx3用脂质体转染人胃癌细胞株SGC-7901,并以空质粒电转SGC-7901作为阴性对照;荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白情况,并且用RT-PCR鉴定Runx3、T-bet、IFN-γ在SGC-7901中的表达水平,分析转染Runx3对胃癌细胞的影响。结果(1)定量PCR结果显示,病人组的Runx3、T-bet和IFN-γ明显低于健康人对照组(p<0.01),Runx3与T-bet以及Runx3与IFN-γ在病人体内的mRNA表达存在正相关性(p<0.01),健康人则否。(2)成功克隆了包括1248bp编码区的人Runx3基因全长,并在大肠埃希菌有效表达,获得了纯化的Runx3蛋白。(3)构建Runx3真核表达载体pIRES2-Runx3,并成功转染SGC-7901细胞,观察Runx3基因对SGC-7901细胞的抑制作用。结论胃癌患者Runx3基因的表达水平与正常人相比明显降低,且胃癌患者Runx3的表达与T-bet、IFN-γ的表达均呈现正相关,说明Runx3与胃癌的发生相关。并参与了胃癌患者的免疫调节作用。获得了人Runx3克隆并在大肠埃希菌中有效表达;制备和纯化了人Runx3蛋白;应用基因转染技术,成功转染了SGC-7901,并检测到转染后细胞分泌IFN-γ,细胞生长产生抑制作用,为基因介入的肿瘤生物治疗奠定了基础。Runx3可以作为诊断胃癌的标准以及生物治疗的一个潜在的靶标。
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