论文部分内容阅读
根干细胞位于植物的根尖,是根持续生长和形成地下器官--根系的基础。拟南芥根的干细胞微环境由静止中心(QC)和周围的干细胞构成,它对于根分生组织的维持至关重要。本文中,我们以拟南芥RAC/ROP小G蛋白的活化因子RopGEF7作为研究对象,综合应用遗传学、分子细胞生物学和生物化学的方法与手段,通过研究其表达模式,分析RopGEF7干涉(RNAi)和RopGEF7△C过表达转基因植株表型,以及研究根干细胞、生长素等报告基因在转基因植株中的表达,揭示了RopGEF7在根干细胞微环境维持中的重要作用及作用机制,获得的主要结果如下:
1)原位杂交及启动子活性分析表明RopGEF7在胚胎发育和胚后发育阶段都在QC细胞表达,可能与QC功能有关;
2)通过RNA干涉技术下调ROPGEF7表达影响胚胎发育阶段QC的特化与维持,导致胚胎发育的缺陷,并影响胚后发育阶段QC的维持,引起QC与干细胞的分化,进一步导致分生组织区细胞分裂活性下降和根生长受到抑制,表明RopGEF7对于根干细胞微环境的维持是必需的;
3)原位杂交实验表明RopGEF7RNAi胚胎和幼苗阶段根干细胞微环境决定基因PLT1的表达均出现下调或缺失,表明RopGEF7与PLT1存在互作,可能通过后者作用于干细胞微环境;
4)通过分析SCRpro-GFP、SHRpro-SHR-GFP、PLT1pro-PLT1-YFP和PLT2pro-PLT2-YFP等根干细胞微环境特异性的报告基因在RopGEF7RNAi胚胎与幼苗中的表达,发现与野生型相比,SCR和SHR的表达在胚胎发育和胚后发育阶段都没有变化,而PLT1/2的表达出现下调或缺失,因此RopGEF7独立于SHR/SCR途径,而与PLTS存在互作;
5)RopGEF7RNAi shr-2杂交组合与两个亲本相比,根长和分生组织区都变得更短,表现出加性效应,而RopGEF7RNAi plt1-4 plt2-2杂交组合根的表型与plt1-4 plt2-2双突变体一致,进一步说明RopGEF7独立于SHR途径而与PLTS存在互作;
6)RopGEF7pro-GUS在plt1-4 plt2-2双突变体中的表达与野生型相比基本没有变化,说明RopGEF7可能作用于PLTs的上游;
7)过表达RopGEF7△C在幼苗子叶及茎顶端区域引起根的异位发生,而且这些部位能检测到PLT1/2蛋白的异常积累,表明RopGEF7过表达异位活化了PLT1/2;
8)RopGEF7的表达受外源生长素的诱导,而ROPGEF7RNAi胚胎与幼苗根尖不能形成正常的生长素响应峰值,同时RopGEF7RNAi胚胎发育和胚后发育阶段生长素输出载体PIN1的表达受到抑制,表明RopGEF7是生长素信号网络的整合因子之一,参与了依赖于生长素的发育模式的建立;
9)酵母双杂交和体内双分子荧光互补实验证实RopGEF7与At RAC1的互作。
综上所述,RopGEF7的表达受生长素诱导,同时RopGEF7在胚胎和幼苗阶段调控生长素输出载体PIN1的表达以及根尖生长素峰值的维持,表明RopGEF7参与生长素起源的位置信号(auxin derived positional information)的建立,活化下游RAC/ROP信号途径,调控PLT转录因子,参与了根干细胞微环境的维持。