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目的:利用Transwell体系建立肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibro blast,CAF)与MDA-MB-231细胞共培养模型,探讨丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、转移及其分子机制,揭示丹栀逍遥散可能通过调控CAF途径抑制乳腺癌。材料与方法:45只SPF级SD雄性大鼠(250±10)g,适应性饲养7d后,按随机数字表法将大鼠随机分3组,即空白组、丹栀逍遥散组、西黄丸组,每组15只。按照人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠丹栀逍遥散等效剂量为8.99g·kg-1,大鼠西黄丸等效剂量为0.55g·kg-1,空白组给予生理盐水灌胃,每组连续给药7d,每日1次。在末次给药1h后,麻醉,腹主动脉取血。室温条件下放置2h,使用低温离心机分离血清,在4℃、1500rpm·min-1条件下,将血液离心10min。收集同组血清并56℃灭活30min。将灭活的血清分装在1.5m L的EP管中,放置于-80℃条件下保存。运用条件培养基诱导HMF细胞转化为CAF,免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达,鉴定模型。运用CCK-8法检测15%丹栀逍遥散含药血清在作用12h、24h、48h、72h时,通过调控CAF分别对MDA-MB-231细胞增殖的影响;细胞侵袭实验检测丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;细胞黏附实验检测丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞黏附能力的影响;流式细胞术分析丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞凋亡与细胞周期的影响;免疫印迹法(Western blot)检测丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对MDA-MB-231细胞低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、单羧酸转运蛋白1(Monocarboxylate transporter 1,MCT1)、单羧酸转运蛋白4(Monocarboxylate transporter 4,MCT4)、小窝蛋白-1(Caveolin-1)、CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)、CD47、巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory,MIF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)蛋白表达的影响。结果:1.CAF的鉴定免疫荧光结果显示,α-SMA在HMF细胞中表达很低,而在CAF中表达明显增高(P<0.01)。2.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖能力的影响CCK-8结果显示,给药干预72h,15%丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF抑制MDAMB-231细胞增殖最明显(P<0.01),因此选择15%丹栀逍遥散含药血清干预72h为以下实验条件。3.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响细胞侵袭实验结果显示,各组穿透小室膜底细胞数依次为:肿瘤组(24.80±2.51)、共培养组(68.13±6.99)、丹栀逍遥散组(42.33±4.32)、西黄丸组(30.60±3.33)。与肿瘤组相比,共培养组MDA-MB-231细胞侵袭能力明显增强(P<0.01);与共培养组相比,丹栀逍遥散组MDA-MB-231细胞侵袭能力显著减弱(P<0.01);与共培养组相比,西黄丸组MDA-MB-231细胞侵袭能力显著减弱(P<0.01)。4.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附能力的影响细胞黏附实验结果显示,各组细胞黏附个数为:肿瘤组(25.00±1.97);共培养组(63.67±3.80);丹栀逍遥散组(49.80±3.86);西黄丸组(28.93±2.27)。与肿瘤组相比,共培养组MDA-MB-231细胞黏附能力显著增强(P<0.01);与共培养组相比,丹栀逍遥散组MDA-MB-231细胞黏附能力显著减弱(P<0.01);与共培养组相比,西黄丸组MDA-MB-231细胞黏附能力显著减弱(P<0.01)。5.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响结果显示,与肿瘤组相比,共培养组MDA-MB-231细胞凋亡率明显下降(P<0.01);与共培养组相比,丹栀逍遥散组MDA-MB-231细胞凋亡率明显上升(P<0.01);与共培养组相比,西黄丸组MDA-MB-231细胞凋亡率明显上升(P<0.01)。6.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞周期的影响结果显示,肿瘤组G1期细胞比率为(55.88±1.29)%;共培养组G1期细胞比率为(39.30±1.88)%,与肿瘤组相比,差异有统计学意义(P<0.01);丹栀逍遥散组G1期细胞比率为(44.27±0.64)%,与共培养组相比,差异有统计学意义(P<0.05);西黄丸组G1期细胞比率为(50.05±2.60)%,差异有统计学意义(P<0.01)。肿瘤组S期细胞比率为(30.25±0.53)%;共培养组S期细胞比率为(46.86±0.62)%,与肿瘤组相比,差异有统计学意义(P<0.01);丹栀逍遥散组S期细胞比率为(41.46±0.88)%,与共培养组相比,差异有统计学意义(P<0.01);西黄丸组S期细胞比率为(34.96±0.76)%,与共培养组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。7.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞中HIF-1α、MCT1、MCT4、Caveolin-1蛋白表达的影响Western blot结果显示,与肿瘤组相比,共培养组HIF-1α、MCT1、MCT4蛋白表达均有升高(P<0.01),Caveolin-1蛋白的表达水平降低(P<0.01);与共培养组相比,丹栀逍遥散组HIF-1α、MCT1、MCT4蛋白表达均有降低(P<0.01),Caveolin-1蛋白的表达水平升高(P<0.01);与共培养组相比,西黄丸组HIF-1α、MCT1、MCT4蛋白表达均有降低(P<0.01),Caveolin-1蛋白的表达水平升高(P<0.01)。8.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞中IL-6、IL-8、CD47、MIF蛋白表达的影响Western blot结果显示,与肿瘤组相比,共培养组IL-6、IL-8、CD47、MIF蛋白表达均有升高(P<0.01);与共培养组相比,丹栀逍遥散组IL-8、CD47、MIF蛋白表达均有降低(P<0.01),IL-6蛋白表达降低(P<0.05);与共培养组相比,西黄丸组IL-6、IL-8、CD47、MIF蛋白表达均有降低(P<0.01)。9.丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF对乳腺癌MDA-MB-231细胞中CXCR4、collagenⅠ蛋白表达的影响Western blot结果显示,与肿瘤组相比,共培养组CXCR4、collagenⅠ蛋白表达均有升高(P<0.01);与共培养组相比,丹栀逍遥散组CXCR4、collagenⅠ蛋白表达均有降低(P<0.01);与共培养组相比,西黄丸组CXCR4、collagenⅠ蛋白表达均有降低(P<0.01)。结论:1.丹栀逍遥散含药血清可通过调控CAF,抑制MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、黏附能力,促进MDA-MB-231细胞凋亡,使MDA-MB-231细胞阻滞在G1期。2.丹栀逍遥散含药血清能够下调HIF-1α、MCT1、MCT4、CD47、MIF、CXCR4、IL-6、IL-8、collagenⅠ蛋白的表达,上调Caveolin-1蛋白的表达,提示丹栀逍遥散含药血清通过调控CAF,抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长、转移,可能与其调控低氧环境下乳酸代谢异常、炎症因子改变、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)失衡有关。