植物寄生线虫是目前全球植物侵染性病害的主要病源之一,这些病源线虫广泛分布,给经济作物带来严重危害,造成作物产量损失或产品质量降低,每年对农林业生产造成的经济损失高达上千亿美元。传统的农业防治措施工作量大、操作复杂,且效果不甚理想。后来发展起来的化学防治方法虽然简单易操作,但对环境和生态都产生很大威胁。因此开发新型防治效果好、环境污染小的抗线虫资源显得尤为迫切,那些能侵染并致线虫死亡的微生物因此成为科研工作者们的研究重点。目前报导的对线虫具有较高毒性作用的微生物已有很多,例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)等,但迄今尚未有报导丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)对线虫的毒杀作用。本实验室分离鉴定了一株丁香假单胞菌亚种MB03,并完成了对该菌的全基因组测序。通过对线虫的生物活性测定发现其对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)及南方根际线虫(Meloidogyne incongnita)均有较高的毒杀作用。丁香假单胞菌是典型的植物致病菌,本实验室首次直接用MB03的活菌体及热致死菌体喂养线虫,研究结果显示其对动物性害虫线虫也具有侵染致死的活性。为鉴定参与丁香假单胞菌中与线虫毒杀活力相关的基因及相关分子学机制,本课题利用了转座子pUT mini-Tn5Km2随机突变的方法构成功构建了包含1256个突变体的丁香假单胞菌MB03转座突变文库,并通过液体杀虫(liquid killing assay)筛选得到了 12株对线虫毒杀作用明显减弱的突变株,因此推测Tn5转座子的插入可能导致了这12株突变株的杀虫活力降低。通过热不对称性PCR(hiTAIL-PCR)与Sanger测序技术我们得到了上述突变株Tn5转座子插入位点的侧翼序列信息。借助两款常用的核酸序列分析软件vectorNTI及BioEdit,将测序得到的碱基序列比对回丁香假单胞菌MB03参考基因组,最终得到7株毒力减弱突变株中Tn5转座子在基因组中的准确插入位置以及插入位点上下游的基因信息。基于上述实验以及生物信息分析结果,我们建立了这些基因可能通过直接或间接的方式参与了丁香假单胞菌MB03对线虫的毒杀过程的假设,为验证这一假设,使用分子克隆技术分别构建了相关基因的表达重组菌以及相关突变菌株的功能补偿菌株以及增效菌株。首先利用筛选出的丁香假单胞菌突变体做了一系列线虫相关的生测实验,包括这些菌株对线虫取食偏好性、生长速度、产卵率以及其肠道定殖率影响的分析,结果发现这些突变体较之MB03对线虫各方面影响更小,表明这些突变体缺失基因在对线虫毒杀过程起到一定作用。再构建出这些基因的表达重组菌、补偿菌株、增效表达菌株进一步验证实验结果,本此研究成功构建出5个基因的表达重组菌及2个基因的补偿及增效表达菌株,通过实验最终确定一个假定蛋白和脂蛋白可能起到直接杀线虫作用,三磷酸腺苷酶及外膜孔蛋白在线虫毒性中发挥间接了作用。本课题对挖掘生物防治植物线虫的新型基因及菌种资源具有启发作用,也可为将来研制抗虫植物或抗虫剂提供基因资源。本课题首次利用植物病原菌丁香假单胞菌侵染动物性害虫,对于以后其他科研人员研究非动物病原菌侵染动物机制具有一定启示和依据。