蛋白质N-糖基化是糖链在糖基转移酶和糖苷酶作用下与特定的天冬酰胺侧链共价结合的过程,是一种重要的蛋白质翻译后修饰。糖链一方面通过调节所连接蛋白质自身性质（如构象）发挥间接功能,另一方面可与受体蛋白结合发挥直接识别功能,包括细胞黏附、信号转导和免疫反应等。目前,N-糖基化研究集中于糖链结构表征、功能研究以及疾病相关异常糖基化分析,而构建结构明确且种类丰富的糖链和糖肽标准品库分别是结构功能糖组学研究和异常糖基化准确定量分析的基础。本论文基于课题组自主研发亲水色谱固定相,发展了 N-糖链/糖肽二维色谱分离纯化方法,结合串联质谱分析,实现天然N-糖链/糖肽标准品的纯化制备与结构表征。在结构明确的糖链/糖肽标准品基础上,开展糖链的芯片制备与基于质谱的人血清和单抗药物中糖肽的准确定量分析研究。首先,发展了非衍生化天然中性N-糖链的二维色谱分离纯化方法,结合串联多级质谱分析,实现了鸡卵清蛋白中31个中性N-糖链（质量范围1.3-254.3 μg）的纯化制备与结构表征。其中,包括7对糖链异构体,5种未报道N-糖链结构。最终,通过拟糖脂技术,将纯化制备N-糖链固定至糖芯片上。平分型N-乙酰葡萄糖胺修饰的混合型糖链与小麦胚芽凝集素间具较高亲和力,表明纯化制备N-糖链在结构功能糖组学中应用潜力。其次,发展了人免疫球蛋白G（IgG）Fc-糖肽的二维亲水色谱分离纯化方法,结合串联质谱分析,实现了 1 1个IgG-1和9个IgG-2 Fc-糖肽的纯化制备与结构表征。并根据糖肽摩尔浓度与其去糖基化肽段摩尔浓度相等的原则,利用内标曲线法测定去糖基化肽段摩尔量,从而实现了微量糖肽含量的测定,质量范围为1.07-335.69 μg。基于纯化制备的IgG-1 Fc-糖肽标准品,发展了人血清中11个高丰度IgG-1 Fc-糖肽的绝对定量分析方法,实现了小样本急性心肌梗死患者与健康人血清中1 1个高丰度IgG-1 Fc-糖肽的含量测定。与直接采用峰面积归一化的相对定量方法相比,引入糖肽校正标准品的方法克服了不同糖型糖肽质谱响应差异的影响,定量结果更准确。为了进一步丰富Fc-糖肽标准品库,发展了单抗特异性Fc-糖肽的二维亲水分离纯化方法,结合串联质谱,实现了 IgG1融合蛋白中15个Fc-糖肽的纯化制备与结构表征。基于26个Fc-糖肽校正标准品,系统比较了引入Fc-糖肽标准品前后不同质谱策略在曲妥珠单抗Fc-糖肽含量测定中的差异。并采用糖肽校正标准品的HILIC-MRM方法,实现了 6种IgG1型单抗药物每种糖型Fc-糖肽含量、糖基化水平以及糖基化位点覆盖率的准确测定。与此同时,也实现了该法在不同平台不同仪器间的转移。