肌醇是一种水溶性维生素,它参与信号传导、生长调节、生物膜的形成等多种生命活动,广泛应用于医药和化妆品等各大行业。本研究前期通过碳源协同利用策略解决了细胞生长与生产之间竞争碳源的问题,实现了葡萄糖到肌醇100%的转化。但工程菌株仍存在发酵周期长、甘油消耗大、发酵温度低等问题,限制了其工业应用。针对上述问题,本研究进一步开展了菌株代谢优化及发酵放大研究,主要研究结果如下:首先,通过双质粒表达增强合成途径,肌醇产量提高18.1%。为降低甘油消耗,表达了葡萄糖辅助扩散系统,利用低、中、高三种拷贝调节其表达水平,平衡葡萄糖的转运与转化,完全转化20 g/L葡萄糖的时间由96 h缩短至72 h,甘油消耗量降低了20%至0.4 g/g。为了进一步增加质粒稳定性,敲除了大肠杆菌基因组上的必需基因并分别构建在质粒上,使得发酵过程中菌株必须在质粒存在的条件下才能生长,同时,必需基因能代替抗生素对菌株进行筛选。去除抗生素和昂贵诱导剂,菌株转化能力不变。为了降低制冷能耗和成本,将发酵温度由30℃提高至35℃时,肌醇产量达到了19 g/L。此外,与质粒表达相比,基因整合能增加菌株稳定性,减少细胞间的变异性。利用CRISPR/Cas9技术将肌醇合成途径整合至大肠杆菌基因组,基础产量随拷贝数增加而逐步增加,整合三个拷贝摇瓶产量达到6.29 g/L。携带单质粒的整合菌株72 h肌醇产量达到19.33 g/L,与双质粒菌株相当,减少了质粒数量。最终,通过分批补料发酵优化,肌醇最高产量达到75.01 g/L,消耗甘油和葡萄糖的质量比为0.44。这项工作为实现高效生物合成肌醇工业化生产奠定了基础。