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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种猪的病毒性传染病。本试验通过研究IgG单体在PRRSV侵染PAM细胞的过程中的作用，为探讨FcγRⅠ在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。PRRSV感染后往往引起副猪嗜血杆菌等革兰氏阴性细菌继发感染，本试验初步研究了LPS对PRRSV感染的影响，为更加深入的探讨PRRSV与细菌混合感染的致病机制奠定基础。本研究从健康猪肺收集PAM细胞，提取总RNA，设计一对FcγRⅠ胞外区(除去信号肽)的特异性引物FY。用RT-PCR方法扩增出其基因片段，大小约为822bp，将这基因片段亚克隆到pET-32a载体中，构建重组表达质粒pET-FY。在IPTG的诱导下成功表达，获得了分子量大小约为47.2KD的重组蛋白FY，与预期的蛋白分子量相符；通过优化表达条件，大量表达重组蛋白，用尿素法对表达的蛋白进行纯化与复性。用纯化蛋白免疫小鼠，制备抗重组蛋白FY的多克隆抗体，经间接ELISA检测，效价为1:12800，并做免疫印迹试验，结果显示制备的多抗可以与各自的重组蛋白特异性结合，表明表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。本研究用纯化的兔IgG（3.0mg/mL）经皮下免疫猪，每头2.2mL，用琼脂扩散试验检测血清中抗兔IgG抗体效价，待抗体效价达到1：32时鼻腔接种PRRSV，接种后4d、6d、9d、13d、17d、20d、23d、26d、39d、47d、51d分别采集血液样品制备血清，用荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV病毒核酸，并用ELISA方法检测抗PRRSV抗体效价，结果显示，免疫感染组猪感染后4-39天均可在血清中检测到PRRSV核酸，而接毒对照组则只在4-26d天检测到病毒核酸，免疫感染组病毒血症比感染对照组持续时间延长8天，且免疫感染组在4d、6d、9d、13d、17d、23d、26d、39d时PRRSV mRNA水平均较接毒对照组略微升高。免疫组血清ELISA抗体检测在9d、13d、17d、23d均为PRRSV抗体阳性，阳性抗体在体内维持15天；接毒对照组血清ELISA抗体检测在6d、9d、13d、17d均为阳性，阳性抗体在体内维持12天；其中在13d和17d时免疫组血清抗体效价较接毒对照组稍高，以上结果说明猪体内PRRSV非特异性IgG能促进病毒感染。本研究通过先将终浓度为1.30mg/mL的PRRSV阴性健康猪IgG于37℃处理PAM细胞12h后，再将100个TCID50的PRRSV病毒液0.2mL接种PAM细胞，并设接毒对照组，通过荧光定量RT-PCR方法分别测定感染后12h、24h、36h、48h PRRSV拷贝数变化，结果显示，PRRSV阴性健康猪IgG处理组PRRSV在各时间段拷贝数均较接毒对照组显著提高，其中12h最高，拷贝数是对照组的11.7倍，48h最低，是对照组的3.5倍，说明PRRSV非特异性猪IgG经FcγRⅠ促进PRRSV在PAM细胞中的复制。本试验通过将鼠抗猪FcγRⅠ胞外区重组蛋白多抗加入PAM细胞作用1h后接种PRRSV，分别培养12h、24h、36h、48h后，收集细胞及上清，同时鼠阴性血清加入PAM细胞作用1h后接种PRRSV作为对照，用real-time PCR方法检测PAM细胞中病毒拷贝数，结果显示，各时间段鼠抗猪FcγRⅠ胞外区重组蛋白多抗处理试验组PRRSV拷贝数与阴性血清处理组相比各时间段均增高，其中24h最高升高6.3倍。本研究通过将鼠抗猪FcγRⅠ胞外区重组蛋白多抗加入PAM细胞作用1h后分别培养12h、24h、36h、48h，收集细胞及上清，同时做鼠阴性血清处理组和健康细胞对照组，用real-time PCR方法检测PAM细胞中IFN-α、TNF-α、IL-10mRNA水平。结果显示，特异性抗体处理试验组与阴性血清处理对照组相比12h、24h、36h、48h IFN-α mRNA水平均升高，其中12h最多升高3.9倍；特异性抗体处理试验组与阴性血清对照组相比，TNF-αmRNA水平各时间段均升高，其中12h、24h显著升高；特异性抗体处理试验组与阴性血清处理对照组相比，IL-10mRNA转录水平各时间段均显著降低。以上试验说明PAM细胞内激活FcγRⅠ能够促进IFN-α、TNF-α mRNA的转录，而抑制IL-10mRNA转录，由此推测PRRSV感染前期通过FcγRⅠ介导的PAM细胞吞噬作用促进病毒增殖，后期抗病毒因子发挥抑制病毒增殖作用。本试验为深入研究FcγRⅠ在PAM细胞抗病毒免疫中所起的作用奠定了基础。将PRRSV病毒接于培养PAM细胞的24孔细胞培养板中，200μL/孔，12h后加入终浓度100ng/mL LPS的RPMI1640营养液（V+L组）；将终浓度100ng/mL的LPS RPMI1640营养液接于培养PAM细胞的24孔细胞培养板，培养12h，每孔加病毒液200μL（L+V组），设病毒感染对照组（V组），均以加入病毒液时开始计时同时设LPS诱导对照组（LPS组）。培养12h、24h、36h、48h收集细胞及上清，同时设健康细胞对照组。用real-time PCR方法检测PAM细胞中的PRRSV拷贝数和IFN-α、IL-10mRNA转录水平。结果显示，V+L组与V组相比，各时间段PRRSV拷贝数均显著降低；L+V组PRRSV拷贝数各时间段均比V组显著降低；LPS组IFN-α mRNA水平与健康细胞对照组相比，48h显著提高，其余时间段相差不大；LPS组IL-10mRNA水平与健康细胞对照组相比各时间段差异均不显著；由此得出LPS能够显著抑制PRRSV在PAM细胞中的增殖，LPS轻微促进健康PAM细胞IFN-α mRNA的转录，而对健康PAM细胞IL-10mRNA的转录调节作用不明显。V组IFN-α mRNA水平与健康细胞对照组相比，各时间段均降低，且36h和48h显著降低，V组IL-10mRNA水平与健康细胞对照组相比各时间段均显著升高；V+L组IFN-α mRNA水平与V组相比在24h、36h、48h均显著升高，其中48h时最高达11倍，且整体呈上升趋势，V+L组IL-10mRNA水平与V组相比在24h、36h、48h均显著降低，且整体呈下降趋势；L+V组各时间段IFN-αmRNA水平与V组相比均显著升高，而整体呈下降趋势，L+V组各时间段IL-10mRNA水平与V组相比均显著降低。以上研究表明， PRRSV存在时LPS诱导IFN-α mRNA转录的效应加强，且显著抑制IL-10mRNA的转录，从而加强PAM细胞的抗病毒免疫效应。本研究为更加深入的探讨PRRSV与细菌混合感染的致病机制奠定了基础。