尼古丁(烟碱)是烟草植物合成的主要生物碱,广泛存在于烟草制品中。由于尼古丁的杂环化合物结构,使其具有良好的水溶性,易穿过生物膜和血脑屏障,对人类有较大的毒害作用。同时尼古丁也是环境毒害物质,在烟草加工过程中存在大量富含尼古丁等化合物的固体和液体废弃物。如果这些废弃物不经处理直接进入环境,就会造成严重的环境污染,威胁生态平衡和人类健康。为了保护人类健康和生态环境,降低烟草和烟草废弃物里的尼古丁含量非常有必要。工业上利用微生物进行降解尼古丁具有明显的优势,可以增加烟草制品的香气、降低刺激性、改进烟气品质,提高吸烟的安全性。微生物来源方便,具有较强的降解尼古丁能力,操作工艺简单,将其应用于工业上降低烟草尼古丁含量具有重大的经济效益和社会效益。国内外在利用微生物降解尼古丁方面早已开展了大量的基础研究和应用研究工作。目前发现在烟草植株、土壤和烟叶中存在的能降解尼古丁的微生物主要有假单胞菌、纤维单胞菌、烟草节杆菌、球形节杆菌、嗜尼古丁节杆菌、氧化节杆菌、争论产碱菌以及微球菌等菌种,其中节杆菌属和假单胞菌属细菌降解尼古丁研究较深入;真菌降解尼古丁仅有少量文献报道。至今为止,仅有节杆菌属和假单胞菌属的细菌对尼古丁的代谢途径已经研究清楚;真菌降解尼古丁的研究极少,且其中的尼古丁代谢途径研究止步于发现初始步骤为尼古丁去甲基化。并且目前国内外对尼古丁降解酶类的研究主要集中在节杆菌属和假单胞菌属细菌,对真菌降解尼古丁的酶学机制研究尚未开展。本实验室在国际上首次提出一条全新的米曲霉Aspergiilus oryzae 112822降解尼古丁的代谢途径,填补了真菌尼古丁代谢途径的空白。但是该代谢途径涉及到的酶及其分子生物学研究仍属于空白。本文针对A.oryza 112822尼古丁代谢途径中,第一步催化尼古丁去甲基化反应的酶展开研究。目前,已经在人类和烟草植物中发现,尼古丁的去甲基化反应均为细胞色素氧化还原酶P450的参与;也已经有报道真菌中去甲基化反应为细胞色素氧化还原酶基因的作用。本文通过从破碎菌体可溶性上清和膜沉淀两种途径纯化A.oryzae 112822尼古丁去甲基酶,在经过硫铵沉淀、Source-15Q阴离子交换柱层析、Gigapite K-100S柱层析、Superdex200凝胶过滤层析纯化等方法纯化后,虽然未能获得电泳纯的尼古丁去甲基酶,但分离到的活性组分在SDS-PAGE电泳上对应条带集中于50kDa～70kDa之间,正是P450蛋白预测的分子量分布区间。将这一区间内主要蛋白条带切下,胶回收后进行肽指纹鉴定,然后与真菌细胞色素P450数据库(http://p450.riceblast.snu.ac.kr/index.php?a=view)进行比对,成功鉴定出 9 个 P450蛋白。为了研究A.oryzae 112822降解尼古丁代谢途径的相关基因,并进一步筛选编码催化尼古丁去甲基反应的酶的基因,实验设计了含尼古丁的诱导培养基与不含尼古丁的YD培养基作为实验与对照组,米曲霉分别在两种培养基中生长后,提取RNA用于构建RNA-Seq文库并进行测序。RNA-Seq测序分别得到12,036,391、12,364,090 个 reads,总共有 21,542,294 个匹配到 A.oryzae 112822的基因组上,这些reads覆盖了米曲霉基因组88.85%的区域。通过DEGseq软件分析,得到4169个在尼古丁诱导与非诱导两种培养条件下发生转录差异的基因,其中在尼古丁诱导培养条件下转录上调的基因有840个,转录下调的基因有3329个。把发生转录差异的基因与真菌细胞色素P450数据库进行比对分析后发现,米曲霉A.oryzae112822内共有46个细胞色素P450基因(cyp基因)出现转录差异,其中发生转录上调的cyp基因有14个。把在尼古丁诱导组内发生转录上调的14个cyp基因与蛋白质肽谱鉴定出的9个P450蛋白比对分析,发现有四个转录上调的P450蛋白出现在蛋白质肽谱鉴定结果中,基因编号分别为 CYP577A4、CYP55A5v2、CYP5113A1、CYP531C3,肽谱匹配率分别为10%、10%、15%、17%,转录差异水平(log2Ratio(NiC/YD))分别为 8.18621、1.86973、1.366636、1.305211。其中 CYP577A4 是在所有上调的cyp基因里转录差异水平最高的一个基因。可能是米曲霉A.oryzae112822尼古丁去甲基酶基因。该基因的克隆表达和功能验证的进一步研究正在进行中。