牛奶是人类重要的蛋白食品来源,利用人类不可食用作物副产品生产优质牛奶是一个全球性的课题。本研究通过基于多组学的系统生物方法,深入解析了不同质量粗饲料影响奶牛泌乳性能的生理和代谢机制。在明确饲喂玉米秸对奶牛泌乳性能及表观代谢参数影响的基础上,运用代谢组学、宏基因组学、转录组学等分别从四种体液的代谢组、瘤胃微生物代谢的分子机制、肝脏和乳腺关键代谢功能差异进行系统探究;运用系统生物学结果并结合营养学原理制定日粮调控策略,使饲喂含玉米秸日粮奶牛的生产性能达到饲喂苜蓿草奶牛同样水平,产生了显著的经济和环境效益。1.玉米秸秆日粮对奶牛生产性能及表观代谢参数的影响本部分以苜蓿干草为主要粗料源的日粮为对照,研究了玉米秸为主要粗料日粮对奶牛产奶量、乳成分、瘤胃发酵参数及血液生化指标的影响。试验选取健康无病的经产中国荷斯坦奶牛16头(产奶量=29.4±2.16kg/d;泌乳天数=164±27.5d),随机分为两组,每组8头。两组日粮采用等氮非等能设计,精粗比均为55:45(DM基础),但粗饲料来源不同(DM):(1)23%苜蓿干草+7%中国羊草(AH);(2)30%玉米秸秆(CS)。结果显示,两组间干物质采食量没有显著差异(P=0.43);饲喂CS日粮奶牛的产奶量、饲料转化率极显著低于饲喂AH日粮奶牛(P<0.01),乳蛋白含量(P = 0.04)和乳糖含量(P = 0.02)也显著低于AH组。CS组瘤胃总VFA中乙酸、丙酸含量分别极显著高于和低于AH组(P<0.01),其乙酸丙酸比极显著高于AH组(P<0.01);血液葡萄糖浓度CS组显著低于AH(P = 0.03)。这说明相对于AH日粮,饲喂CS日粮奶牛泌乳性能低下,瘤胃中丙酸含量较低,乙酸含量较高,血糖浓度低下。2.玉米秸秆日粮影响奶牛泌乳能的生理和代谢机制本部分应用代谢组学、宏基因组学和转录组学及不同组学之间的关联分析,系统研究了奶牛多体液跨器官的关键功能和代谢通路,阐明了 CS组奶牛生产性能低下的分子机制。2.1基于四种体液的奶牛机体系统代谢机理于试验期第65天晨饲前采集16头奶牛的瘤胃液、血清、牛奶和尿液样品,通过基于气相色谱-飞行时间检测器串联质谱仪(GC-TOF/MS)的代谢组学技术检测四种体液中的代谢物质。在瘤胃液、血清、牛奶和尿液中分别解析出165、218、195和156种代谢物质,其中有29种为四体液共有代谢物质。基于共有物质的显著相关通路为甘氨酸-丝氨酸-色氨酸代谢、甘油脂代谢、苯丙氨酸代谢和酪氨酸代谢通路(P<0.05&Impact valud>0.1)。瘤胃液、血清、牛奶和尿液中分别鉴定得到55,28,8和31种显著差异代谢物质(VIP>1&P<0.05),对应的关键代谢通路为丝氨酸-色氨酸代谢,酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢。对8头AH组奶牛四种体液的代谢组进行关联分析发现,肌酸是区分四组体液代谢差异的关键物质(FDR<0.01,VIP= 1.537),富集最显著的通路包括糖异生通路、丙酮酸代谢、三羧酸循环、甘油酯代谢和天冬氨酸代谢(FoldEnrichment>2,FDR<0.05)。代谢组学分析显示,两处理组间最大的差异是氨基酸代谢通路,最富集的通路与碳水化合物代谢有关。2.2宏基因组-代谢组研究奶牛瘤胃代谢的分子机制选用同样16头牛瘤胃内容物,提取DNA,利用IllulluminaMiSeq进行2x300bp双向测序。利用宏基因组学快速注释或子系统技术(MG-RAST)分析平台解析瘤胃微生物多样性及其功能。共检测到古菌、细菌和真核生物计60个门,784个属和3560种的微生物。细菌门水平上,CS组中Proteobacteria、Fibrobacteres和Lentisphaerae的相对丰度显著高于AH组(P<0.05);在细菌属水平上,CS 组中 Bacteroides,Parabacteroides,Porphyromoas,Paludibacter,Fibrobacter和Victivallis的相对丰度显著高于AH组(P<0.05),而Treponema和Succinimonas显著低于AH组(P<0.05)。细菌种水平上(相对丰度 ≥ 0.01%),仅在 AH 组中发现 T.maltophilum,而 T.sacccharophilum 和 T.succinifaciens在CS组中显著较低(P<0.05)。微生物功能方面,只有碳水化合物代谢功能在CS组显著下调(P=0.028),包括乳酸还原酶、Ⅰ型谷氨酰胺合成酶、甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶、琥珀酸脱氢酶和a-木糖苷ABC转运蛋白(P<0.05)。通过关键微生物宏基因组元件与CS组显著下调的微生物代谢物质关联分析发现,Fibrobacter和11种代谢物质呈显著负相关(R<-0.5,P<0.05),甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶编码基因和3种代谢物质呈显著负相关(R<-0.5,P<0.05),琥珀酸脱氢酶与14种代谢物质呈强正相关关系(R>0.5,P<0.05)。在CS日粮下,较低水平的NFC成分(果胶,果糖和岩藻糖等)引起微生物丰度和碳水化合物相关功能下调,导致17种中间代谢产物显著降低,同时减弱了琥珀酸通路功能,显著减少了丙酸生成。CS组高含量的乙酸与高水平的Fibrobacter属细菌、以及甲基丙二酸单酰CoA脱羧酶功能上调密切相关。2.3代谢组-转录组研究奶牛肝脏关键代谢功能差异本研究从每组8头奶牛中选择6头,分别利用GC-TOF/MS和Illumina HiSeq2000测定肝脏组织中的代谢产物和基因表达图谱。共解析到515个有效峰,其中有270种代谢产物,两组间存在28种差异代谢物质(VIP>1&P<0.05),其中CS组有15种代谢物质显著下调,13种代谢物质显著上调。根据独创通路分析(IPA)结果,在肝脏中共鉴定得到11条显著不同的功能通路(P<0.01,|z-score|>2),差异最大的功能通路为氨基酸代谢通路和糖异生通路(P<0.001,z-score<-2)。参与氨基酸代谢的代谢物质通路拓扑图显示,甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢是两组日粮中差异最大,富集程度最高的通路(P =0.029,Impactvalue = 0.597)。亮氨酸、胱氨酸和马尿酸作为差异代谢表征物可以代表两组间99.9%的差异。基于RNA-Seq在肝脏组织中共鉴定得到11371个基因,利用基因共表达网络得到18个不同基因模块,通过对代谢表征物和基因模块的关联分析发现,糖异生功能、丙酮酸代谢、单糖生物合成过程、葡萄糖稳态、己糖生物合成是在CS组显著下调的基因功能。转录组-代谢组整合分析显示肝脏中最关键的功能差异来自CS组糖异生通路丰度和功能均显著下调,伴随了多种中间代谢产物和编码关键酶的基因相对丰度较低,这很可能是CS组瘤胃中丙酸含量显著降低造成,而这也影响了到乳腺组织的葡萄糖供应。2.4代谢组-转录组研究奶牛乳腺关键代谢功能差异利用上述同样的奶牛,分析了奶牛乳腺组织关键代谢功能的差异。共解析到493个有效峰,其中有273种代谢产物,两组间共9种差异代谢物质(VIP>1&P<0.05),其中有3种代谢物质在CS组显著下调,6种代谢物质在CS组显著上调。在CS组所有显著下调的功能通路中,差异最大的为氨基酸摄取、L-氨基酸摄取、碳水化合物代谢和葡萄糖-6磷酸氧化(P<0.001,z-score<-2)。表征物组合(马来酸、连苯三酚和琥珀酸)可以预测两组间乳腺组织99.6%的代谢差异。基于RNA-Seq在乳腺组织中检测鉴定得到10174个基因。代谢表征物-基因共表达模块关联分析结果显示,钙离子绑定、乙酰化、分泌及膜流动性等相关基因功能在CS组下调。上述结果表明,CS组乳腺葡萄糖供应不足及乳糖合成相关功能下调造成了乳腺乳糖合成量减少,从而引起奶产量下降;CS组血中氨基酸含量下降及乳腺氨基酸摄取、利用、分泌及膜功能的下调,共同造成了乳蛋白低下。3.基于多组学结果的营养调控研究在系统梳理了多组学试验结果的基础上,本部分结合营养学知识并考虑经济和环境因素制定了基于玉米秸秆日粮的优化方案。选取日产奶量27kg左右的健康无病的经产中国荷斯坦奶牛39头,随机分为3组,每组13头,第一、二组试验日粮同前期试验一致,分别饲喂CS和AH,第三组采用优化日粮(CSM):保留23%玉米秸秆,增加苜蓿干草(7%)和可溶性糖粉(4.8%甘蔗糖蜜),降低玉米使用量(3.9%)和麦麸使用量(5%),补充了氨基酸(41.4g/d赖氨酸盐酸盐+14.1 g/d蛋氨酸),调整饼粕组成使三个日粮的粗蛋白水平一致。CSM组的泌乳净能高于CS组(1.52vs.1.45Mcal/kgDM),但低于AH组(1.57Mcal/kgDM)。整个试验期持续监测产奶量,共记录1404次产奶量(3次/周/牛),每周测定一次乳成分。结果显示,CSM组奶牛的平均产奶量极显著高于CS组(P<0.0001),与AH组中没有差异(P=0.435)。CSM组乳蛋白含量极显著高于CS组(P=0.008),与AH组也无显著差异(P=0.946)。同样地,乳糖含量在CSM中极显著高于CS组(P=0.0006)但与AH组无差异(P=0.308)。上述结果说明,利用多组学研究结果并结合营养学理论制定调控策略,可有效利用玉米秸秆等农副产品资源,不仅可大幅降低生产成本,而且也具有显著的环境效益。综上所述,横跨瘤胃液、血清、牛奶和尿液四种体液及瘤胃、肝脏和乳腺三器官的代谢组、宏基因组学和转录组学研究,揭示了饲喂玉米秸秆奶牛乳产量相关的生理和代谢机制,为更好利用人类不可食用作物副产品生产优质牛奶提供了重要的基础知识和实践应用启示。