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铝在地壳中的含量仅次于氧和硅,也是土壤中最丰富的金属元素,主要以对植物无毒害的铝硅酸盐或氧化物的形式存在,但在酸性土壤中,铝以可溶的Al3+形式存在,并被释放到土壤中,抑制植物根系的生长,进而影响根系对土壤水分和矿质养分的吸收,造成牧草作物减产。本课题组在前期研究中发现,丹波黑大豆果胶甲酯酶（Pectin methylesterase）基因Gm PME2在铝胁迫下显著下调表达,而甲酸脱氢酶（Formate dehydrogenase）基因Gm FDH显著上调表达,表明这两个基因与耐铝有关,本研究通过对这两个基因进行耐铝功能鉴定,以期在牧草耐铝育种中发挥作用。丹波黑大豆（Glycine max cv.Tamba）是一种耐铝豆科植物,为了研究丹波黑大豆Gm PME2和Gm FDH的耐铝功能,本研究利用RT-PCR（Reverse transcription PCR）技术从丹波黑大豆中克隆获得了Gm PME2和Gm FDH,并对这两个基因进行耐铝功能验证及耐铝相关分析,主要研究结果如下:（1）GmPME2基因编码区全长900 bp,编码299个氨基酸,等电点为8.85。Gm PME2蛋白不稳定性指数为30.11<40,是稳定蛋白。首先通过q RT-PCR对Gm PME2在丹波黑大豆中的表达进行分析,结果表明Gm PME2在铝胁迫18 h后,呈下调表达;在不同器官中的表达量以根为最高,特别是根尖0-2 cm处;Gm PME2的表达量随铝处理浓度的增加而降低。在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中利用瞬时表达观察到Gm PME2蛋白主要定位在细胞壁上。随后采用重组克隆方法构建表达载体p BI121-Gm PME2-e GFP,通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导遗传转化烟草。通过DNA,RNA水平检测得到9株阳性植株。对RNA水平表达较高的3株进行Western blot验证,证明这3株是蛋白质水平较高的阳性植株。最后对这3个阳性株系进行耐铝分析。结果表明:在铝胁迫下,转基因烟草果胶甲酯酶活性是野生型的1.17倍-1.33倍;转基因烟草根的相对伸长量是野生型的42.85%-85.71%;转基因烟草根尖的伊文思蓝染色、苏木精染色和桑色素染色均比野生型明显加深;转基因烟草根尖MDA含量是野生型的2.28倍-2.57倍,说明过表达Gm PME2基因增加了对铝的敏感性,根尖受铝毒害加深。虽然,转基因烟草根尖POD和SOD活性以及根尖柠檬酸分泌量均比野生型有所增多,以及转基因烟草的耐铝标记基因Nt ALS3和Nt MATE较野生型的表达量也有所提高,但其对转基因烟草耐铝性的增强不足以弥补过表达该基因对根造成的伤害。上述结果表明Gm PME2基因是铝敏感基因,过表达该基因植物耐铝性下降。（2）GmFDH基因编码区全长1128 bp,编码375个氨基酸,等电点为6.87。Gm FDH蛋白不稳定性指数为26.83<40,是稳定蛋白。首先通过q RT-PCR对Gm FDH在丹波黑大豆中的表达进行分析,结果表明,在铝胁迫下,Gm FDH的表达量显著上升;在不同器官中的表达量以根为最高,尤其是在根尖2-4 cm处;各铝处理浓度下基因的表达量差异不显著,因此选择50μmol/L作为后续实验的铝浓度;不同金属处理时表达量为:Al>Ca>Cu>Fe>Mn>Cr>La;丹波黑大豆FDH的活性随p H的降低、铝处理浓度的升高、铝处理时间的延长和外源甲酸盐浓度的增加而增强;丹波黑大豆根尖甲酸盐的含量随p H的降低、铝处理浓度的升高、铝处理时间的延长和外源甲酸盐浓度的增加而增加;丹波黑大豆根尖铝含量随p H的降低、铝处理浓度的升高、铝处理时间的延长和外源甲酸盐浓度的增加而减少。随后采用重组克隆方法构建表达载体p BI121-Gm FDH-e GFP,通过农杆菌介导遗传转化烟草。通过DNA,RNA水平检测得到11株阳性植株。并对RNA水平表达较高的3株进行Western blot验证,证明这3株是蛋白质水平表达比较高的阳性植株,最后对这3个阳性株系进行耐铝分析。结果表明:转基因烟草根的相对伸长量是野生型的2.12倍-2.60倍;转基因烟草根尖的伊文思蓝染色、铬天青染色、苏木精染色和桑色素染色均显示转基因植株根尖着色较野生型植株更浅,表明转基因烟草的耐铝性较野生型明显增强。转基因烟草根尖MDA含量是野生型的83.33%-58.33%倍,H2O2含量是野生型的70.83%-76.67%,POD活性是野生型的1.08倍-1.33倍,SOD活性是野生型的1.10倍-1.24倍;转基因烟草根尖柠檬酸分泌量是野生型的1.84倍-2.10倍。可见,转基因烟草较野生型对铝的耐受性增强。转基因烟草的耐铝标记基因Nt ALS3和Nt MATE较野生型的表达量没有显著差异。上述结果表明,过表达Gm FDH基因的烟草耐铝性增强,说明该基因是一个耐铝基因,为牧草耐铝品种的培育提供基因资源。