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哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起鱼类细菌性病害的一类重要的病原菌。本文从广东阳江患病的红鳍笛鲷肝脏分离到一株致病菌SpGY020601,针对其致病性和疫苗进行了研究。
对该菌进行常规的生理生化鉴定和热激蛋白HSP60基因序列比较鉴定,确认该菌为哈维氏弧菌。用该菌腹腔注射感染斜带石斑鱼、鲫鱼和小鼠,并和其他两株哈维氏弧菌的毒性作了比较,发现三株菌都有比较强的毒力。用Reed-Muench法计算该菌对鲫鱼的LD50为2.1×105CFU/g鱼体重,对斜带石斑鱼的LD50为4.7×106 CFU/g鱼体重。
毒性试验表明该菌的胞外产物具有很强的毒力,对鲫鱼的LD50为3.3μg蛋白/g鱼体重,具有淀粉酶、明胶酶、脂肪酶活性,对小鼠、鲫鱼、斜带石斑鱼、O型人血的红细胞的溶血性都较弱,对草鱼的吻端成纤维细胞(PSF)具有细胞毒性,在pH8.0,50℃时具有最高的蛋白酶活性,不能被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF),金属蛋白酶抑制剂EDTA抑制,金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+都能增强蛋白酶的活性。经HiPerpTM16/60 SephacryiTM S-200(1.6×60cm)聚丙烯酰胺葡聚胶柱层析、HiPerp?16/10 Q XL(1.6×10cm)阴离子柱层析对ECP进行了纯化,收集有蛋白酶活性的部分。SDS-PAGE分析,得到分子量为38kDa的主要蛋白带,该蛋白对鲫鱼有致死毒性。
同时对SpGY020601等7株哈维氏弧菌,以及1株溶藻弧菌、1株创伤弧菌的LPS和OMP的抗原性进行了比较。SDS-PAGE图谱表明,哈维氏弧菌的OMP蛋白条带差异较大,但都有共同的一条36kDa蛋白带。LPS的电泳图谱比较相似,都有34kDa和20kDa的共同O侧链主带。OMP的免疫印迹试验结果显示,除了溶藻弧菌,其他菌株在36kDa处都有共同的免疫反应条带,部分菌株在17kDa处也有免疫反应条带。而LPS的免疫印迹结果表明,SpGY020601株的抗血清只与本身菌株的LPS有免疫反应,基本不与其他菌株发生免疫反应。说明LPS和OMP都有很强的抗原性,哈维氏弧菌的OMP有共同的抗原条带,可以对不同菌株形成交叉免疫保护。
提取哈维氏弧菌SpGY020601的ECP、LPS成分,分别制成各种疫苗,进行了浸泡和注射两种途径免疫鲫鱼,并在浸泡免疫组中LPS和ECP苗另外加入莨宕碱、左旋咪唑和β-1,3葡聚糖作为佐剂。结果表明:各种疫苗都能有效的刺激鲫鱼产生特异性抗体,大部分组在第二、三周达到高峰,到第四周抗体效价开始下降,注射组抗体水平明显高于浸泡组,对照组没有检测到抗体。注射组中,LPS组的保护力最高,ECP最差。浸泡免疫组中,LPS+莨菪碱组最高保护力,HKC组和LPS+左旋咪唑组保护力最低。从鲫鱼的免疫试验中挑选免疫效果相对比较好的组来免疫斜带石斑鱼,接种途径同上,每组中取部分鱼进行二次免疫,在第0周、第4周和第8周测量了鱼体的重量,观察疫苗对试验鱼生长的影响。试验表明二次免疫能有效的激活免疫记忆,增强抗体效价;大部分免疫组都能促进鱼体的生长。浸泡组中,LPS+葡聚糖组取得最好的免疫保护。虽然注射组免疫保护力比浸泡组高,但在实际生产中不实用,而浸泡的最好免疫保护力能达到66.7%,对于昂贵的养殖石斑鱼这是非常有实用价值的。从哈维氏弧菌疫苗对鲫鱼和斜带石斑鱼的免疫试验表明,各种疫苗的免疫效果在两种试验鱼中得到比较好的一致性,说明用鲫鱼代替海水鱼初步筛选弧菌疫苗有一定的可行性。