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目的肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)是肺炎,脑膜炎和中耳炎的主要病因,引起全世界范围内婴幼儿,老年人和免疫缺陷个体疾病的主要病原菌。随着耐药菌株的不断发现,疫苗在其感染防治中的作用越来越重要。目前主要所用的是23价肺炎多糖疫苗和7价结合疫苗,但前者覆盖的血清型有限而且不是T细胞依赖性的,对免疫系统发育不完善的2岁以下小孩和老年人的保护性弱;后者存在荚膜血清型转换和载体携带的荚膜多糖血清型数量有限以及在肺炎高发人群中的保护作用小等问题,并且生产成本很高,不适合在发展中国家大量使用。因此发展肺炎链球菌蛋白疫苗迫在眉睫。肺炎链球菌表面蛋白A( pneumococcal surface protein A,PspA)是S.pn主要的毒力因子之一,在肺炎链球菌侵袭性感染时起着重要的作用,它是最早作为S.pn蛋白质疫苗的候选抗原之一;S.pn胆碱结合蛋白A(choline binding protein A,CbpA)作为S.pn的最为重要的表面蛋白成分之一,在S.pn引起脑膜炎时功能独特,是最关键的毒力因子。而S.pn热休克蛋白ClpP( caseinolytic protease )在S.pn从呼吸道(大约30到34℃)转移到血液和(或)脑膜(37℃),帮助S.pn适应宿主环境从而致病的过程中发挥着重要的功能。因此,本研究拟对上述三种保护性抗原进行克隆表达,通过三种抗原间的不同组合方式来探索联合多肽疫苗相对于单一多肽成分的优势性,并利用抗体被动保护实验来验证保护作用。方法1,用引物修饰法将S.pn基因组中扩增PspA,CbpA和ClpP片段并构建在原核表达载体PET-32a中。应用生物信息学软件DNAssist和GenBank数据库对已公布的TIGR4型S.pn全基因组序列进行相似性分析。将含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,镍柱亲和层析纯化蛋白。应用SDS-PAGE对表达和纯化产物进行分析,透析除盐,并用抗组氨酸单克隆抗体Western blot鉴定。纯化的重组抗原分别免疫BALB/C小鼠,制备相应多克隆抗体血清。2,主动免疫保护实验,将96只BALB/C小鼠随机分为8组(每组12只):对照组,PspA组, CbpA组, ClpP组, PspA+ CbpA混合组, PspA+ ClpP混合组, CbpA+ ClpP混合组, PspA+ CbpA+ ClpP混合组。分别于0.14.28天经腹腔注射免疫,剂量为10 ug/只/次/种抗原。末次免疫后7天,每只小鼠经眼眶取血,ELISA检测免疫后血清特异IgG以证实高效价抗体的产生。7天后,每只小鼠经腹腔感染TIGR4型肺炎链球菌,连续监测21天小鼠的生存时间,计算各组的生存率。3,抗体被动免疫保护实验,将96只BALB/C小鼠随机分为8组(每组12只):对照组,Anti-PspA血清组, Anti-CbpA血清组, Anti-ClpP血清组, Anti-PspA + Anti-CbpA血清混合组,Anti-PspA+Anti-ClpP血清混合组, Anti-CbpA+Anti-ClpP血清混合组, Anti-PspA+ Anti-CbpA+ Anti-ClpP血清混合组。分别经腹腔注射免疫,剂量为100 ul抗血清/只/种抗血清。免疫24小时后,每只小鼠经腹腔感染TIGR4型肺炎链球菌,连续监测21天小鼠的生存时间,计算各组的生存率。结果1,经酶切鉴定和基因测序结果显示,S.pn PspA基因片段被正确克隆到PET-32a原核表达载体中。PspA基因片段的核苷酸序列长度为1329bp,与GeneBank中序列比较,无碱基突变。重组工程菌IPTG诱导,在BL21(DE3)菌中表达出了分子量约为66kD的Trx-PspA融合蛋白。重组蛋白以可溶形式表达,表达量约占全菌蛋白的40%;经Ni-NTA树脂纯化后得到了纯度>90%的重组蛋白。PspA重组蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,Western blot结果显示抗体能够与S.pn菌体蛋白起反应。2,经酶切鉴定和基因测序结果显示,成功构建出原核表达载体pET32a(+)/CbpA。将重组子转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导,表达出了分子量约为80kD的Trx-CbpA融合蛋白。重组蛋白以可溶形式表达,表达量约占全菌蛋白的20%;经Ni-NTA树脂纯化后得到了纯度>90%的重组蛋白。CbpA重组蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,Western blot结果显示抗体能够与S.pn菌体蛋白起反应。3,重组工程菌pET32a(+)/ClpP经IPTG诱导,表达重组工程菌IPTG诱导,在BL21(DE3)菌中表达出了分子量约为42kD的Trx-PspA融合蛋白。重组蛋白以包涵体形式表达,表达量约占全菌蛋白的35%;经Ni-NTA树脂纯化后得到了纯度>90%的重组蛋白。ClpP重组蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,Western blot结果显示抗体能够与S.pn菌体蛋白起反应。4,重组蛋白的主动免疫保护实验,单一重组蛋白及混合组份经腹腔免疫BALB/C小鼠产生高滴度的抗体后,致死量的TIGR4腹腔感染。与对照组相比,抗原免疫组小鼠半数生存时间明显延长(P<0.05)。与其他抗原免疫组小鼠相比,三种亚单位重组蛋白免疫组半数生存时间最长(P<0.05)。PspA免疫只能延长小鼠的生存时间而不能防止其死亡,三种亚单位重组蛋白免疫组保护率为100%,与其他组小鼠(ClpP和PspA混合免疫组除外)相比,具有统计学意义(P<0.05)。5,抗体的被动免疫保护实验,与对照组相比,抗体免疫组小鼠生存时间明显延长(P<0.001)。三种抗体(Anti-PspA+Anti-CbpA+Anti-ClpP)混合免疫组与单一抗体免疫组相比,半数生存时间明显延长(P<0.025)。PspA多克隆抗体血清同样只能延长小鼠生存时间而不能防止其死亡。与单一抗体免疫组小鼠相比,三种抗体混合免疫组保护效率最高(P<0.05)。结论1,成功构建了pET32a(+)/PspA, pET32a(+)/CbpA, pET32a(+)/ClpP原核表达载体。纯化的重组蛋白PspA,CbpA和ClpP,具有良好的免疫原性和免疫反应性,可以作为S.pn基因工程疫苗的候选抗原。2,成功制备了重组蛋白PspA,CbpA和ClpP的多克隆抗血清,它们都能和肺炎链球菌菌体蛋白发生特异性的反应。3,亚单位疫苗主动免疫动物实验结果显示它们能够保护BALB/C小鼠抵抗致死量TIGR4型S.pn的攻击,其中三种疫苗蛋白混合免疫能够产生很好的保护效果,为进一步的S.pn多肽联合疫苗的研制奠定了基础。4,抗血清的被动免疫实验结果显示重组蛋白的多克窿抗体能够能够保护BALB/C小鼠抵抗致死量TIGR4型S.pn的攻击,其中三种抗体联合免疫能够得到最佳的保护效果,进一步证实主动免疫保护实验所取得的结果。