双孢蘑菇湿泡病病原学及其致病机理研究

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双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是一种广泛栽培的食用菌。随着人们对双孢蘑菇需求量的增多,工厂化栽培面积也在不断扩大,病害发生日趋突出。其中,双孢蘑菇湿泡病(wet bubble disease of A. bisporus),是双孢蘑菇生产上的主要病害之一,在许多双孢蘑菇种植区均有发生。近年来,该病害发生面积呈逐年扩增的趋势,且病害危害程度越来越严重。因此,本文针对双孢蘑菇湿泡病菌的病原学、致病力分化、种群遗传多样性、致病机理以及抗性机制进行了较为系统的研究,主要研究结果如下:1.2012-2013年全面调查了山东省聊城市冠县、山东省聊城市莘县、河南省洛阳市、甘肃省永昌县、四川省西充县、湖北省武汉市、福建省龙海市和广西省横县的双孢蘑菇主产区双孢蘑菇湿泡病的发生危害情况。采集典型病菇,通过组织分离获得病原菌38株。根据传统的形态学观察和柯赫氏法则证病试验,并采用分子生物学技术对病原菌基因组rDNA-ITS区进行序列分析,确定双孢蘑菇湿泡病的致病菌为有害疣孢霉(Mycogone perniciosa Magn.)。2.通过采用不同的培养基、碳、氮源、温度、pH、光照、湿度等条件,对病原菌菌丝及分生孢子萌发影响因素试验,结果表明:病原菌菌丝在双孢蘑菇煎汁培养基、25℃、pH6.0条件下生长最好;菌株SD01、GS01和HN01的最适碳源为蔗糖,菌株SC01最适碳源为葡萄糖;菌株HN01和GS01最适氮源为蛋白胨,菌株SD01最适氮源为玉米粉,菌株SC01最适氮源为硝酸铵;病原菌分生孢子萌发最佳温度为30℃,pH6.0,相对湿度100%;光照对菌丝生长和分生孢子萌发影响较小。3.采用离体人工接种法,对采集我国不同地区的双孢蘑菇湿泡病菌38个菌株,进行了致病力分化研究,结果表明:我国双孢蘑菇湿泡病菌存在明显的致病力分化现象,但病原菌的致病力分化与地理来源无明显的相关性。采自山东省聊城市、山东省冠县、福建省龙海市、湖北省武汉市的病原菌菌株致病力最强,病情指数在45.86~41.22之间。4.应用SRAP分子标记技术,以采自我国不同地区的双孢蘑菇湿泡病菌38个菌株为研究对象,筛选出9对较好的SRAP引物,扩增出132条谱带。利用NTSYS软件构建UPGMA系统发育树,结果表明:SRAP标记的供试38株菌株间遗传相似系数在0.59~0.96之间,在遗传相似系数为0.716处,被划分为4个类群。SRAP分析结果表明,我国双孢蘑菇湿泡病菌群体具有丰富的遗传多样性,遗传聚类组群与菌株的地理来源不具有相关性。5.利用电子显微镜技术观察了病原菌在对峙培养中,湿泡病菌与双孢蘑菇菌丝之间的寄生关系。两菌丝交界处,病原菌菌丝与双孢蘑菇菌丝互相缠绕,双孢蘑菇菌丝枯萎,或者出现溶解等现象,还出现了像回形针一样的寄生方式。通过组织细胞学技术,观察了湿泡病菌在双孢蘑菇子实体上的侵染过程,结果显示,病原菌通过分泌的细胞壁降解酶和来自于附着孢产生的机械压力侵染寄主细胞壁。6.通过人工接种湿泡病菌,研究了双孢蘑菇子实体内防御酶系活性的动态变化。结果表明:以双孢蘑菇T258、As2796和W192为材料,在接种处理后,各品种双孢蘑菇子实体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)活性变化不同。双孢蘑菇W192品种4种酶活峰值最高,其次是As2796和T258。说明这4种酶与双孢蘑菇抗湿泡病菌有一定的关联。
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