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目的:胃癌作为消化系统恶性肿瘤之一,在全世界及我国的范围内均位于恶性肿瘤死亡前列。胃癌的治疗手段除手术切除外,还包括放射线治疗、化疗、靶向药物治疗以及生物治疗。现阶段的临床药物治疗中,虽然针对的靶点与治疗机制并不相同,但都是以诱导肿瘤细胞凋亡为主,从而达到杀灭肿瘤细胞的目的[1,2]。但是,大量临床实践表明,在胃癌的药物治疗过程中,最终难以摆脱肿瘤凋亡抵抗的问题,成为临床治疗过程中一个难以克服的障碍[3]。肿瘤细胞产生凋亡抵抗的重要原因是抗凋亡蛋白的过度表达和凋亡信号通路的传导障碍。此外,还受到多耐药抵抗（multiple drug resistance）、肿瘤干细胞介导的肿瘤耐药和肿瘤微环境的影响[4]。因肿瘤细胞凋亡抵抗机制的复杂性,最终很难通过传统的诱导凋亡的方式杀灭肿瘤细胞。然而,近年来有研究者发现了一种新的有序性的细胞死亡方式,并且,这种有序性的细胞死亡方式可以绕过肿瘤细胞凋亡抵抗这一障碍。Degterev[5]在2005年首次提出了坏死性凋亡（necroptosis）这一概念,其研究中发现了坏死性凋亡途径中蛋白分子RIP1的抑制剂NEC-1。与凋亡途径不同的是,在坏死性凋亡发生的早期,会出现细胞膜完整性的破坏、细胞器的肿胀以及线粒体功能的丧失,并且在局部会伴有严重的炎性反应[6,7]。在各种因素所诱导的坏死性凋亡途径中,由肿瘤坏死因子（TNF）这种传统的多效性细胞因子所诱导的“死亡受体-RIP1/RIP3-MLKL-PGAM5”坏死性凋亡途径研究的最为深入[8-12]。在该途径中,能够传递死亡信号的一个必要条件,就是形成RIP1、RIP3和MLKL所组成的坏死复合物（necrosome）[13,14]。有研究发现,在一些内源性不表达或者低表达RIP3的细胞系中,对于坏死性凋亡途径的激活都有明显的抵抗作用,在这些对于坏死性凋亡有抗性的细胞系中表达野生型RIP3后,可以使这些细胞系恢复对于坏死性凋亡的敏感性,与之相反,在高表达RIP3的细胞系中敲除RIP3后,细胞对于坏死性凋亡的敏感度随之降低[15-17]。由此可推测,RIP3在细胞坏死性凋亡过程中是必不可少的因素,并且,RIP1激活后传导坏死性凋亡信号,必须是在RIP3存在的条件下才可以实现。ROS是凋亡或坏死细胞死亡的特征性刺激之一。许多研究表明,ROS在TNF刺激下诱导的坏死性凋亡途径中起着很重要的作用[18,19]。有研究发现,通过苦参碱诱导胆管癌细胞发生坏死性凋亡,并且在加入ROS抑制剂降低细胞内ROS水平后,苦参碱诱导细胞发生的坏死性凋亡能够被抑制。这说明,细胞内ROS水平的升高与坏死性凋亡之间确实存在着密切的联系。在细胞凋亡途径受阻时,坏死性凋亡途径可作为一种备用的细胞死亡途径,且凋亡抵抗的肿瘤细胞并不会影响坏死性凋亡通路的激活[20-22]。这提示我们,如果寻找到坏死性凋亡诱导剂,对于提高胃癌患者远期治疗效果以及克服胃癌细胞凋亡抵抗具有极其重要的意义。蟾蜍灵（bufalin）是从中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物中提取的主要成分之一,分子式为C24H34O4,相对分子量为386.5。蟾蜍灵这种活性物质具有抗癌、强心、麻醉、抗炎镇痛等广泛作用。但其抗癌作用成为了近年来的研究热点。在既往的研究中,普遍认为蟾蜍灵是通过凋亡途径诱导肿瘤细胞死亡。但在回顾既往研究时发现,蟾蜍灵能够诱导肿瘤细胞发生非凋亡性死亡的现象,早就大量出现在研究学者的文章中。Shen S等[23]分别用40nM和80nM的蟾蜍灵处理胶质瘤细胞后,诱导出12.6%和14.8%的细胞坏死,但是对照组中只有2.4%的细胞坏死。同样的,Hu F等[24]在100nM蟾蜍灵处理下的肝细胞肝癌Huh-7和HepG-2细胞系中,诱导出了19.6%和20.4%的细胞坏死,而对照组中只有0.3%的细胞坏死。这些现象的出现并未得到充分的关注。长期以来,人们主要关注于揭示蟾蜍灵通过凋亡途径引起各种肿瘤细胞死亡的机制[25],而蟾蜍灵通过坏死性凋亡途径诱导胃癌细胞死亡的现象及其相关的分子机制还未得到探索和揭示。综合文献报道和前期实验结果,我们提出以下假设:蟾蜍灵可以通过坏死性凋亡途径诱导胃癌细胞死亡;坏死性凋亡途径中关键分子RIP3的表达,可能在蟾蜍灵诱导胃癌细胞发生坏死性凋亡过程中发挥重要作用。本项研究的结果不仅能够揭示蟾蜍灵通过坏死性凋亡途径诱导胃癌细胞损伤的分子机制,为蟾蜍灵诱导胃癌细胞死亡的机制提供新的理论依据,而且能够为将来临床用药以及新的治疗靶点的开发提供新思路。研究方法:1.利用MTT法检测细胞活性,研究Bufalin对胃癌SGC-7901、MGC-803和AGS细胞生长的影响。2.培养胃癌SGC-7901、MGC-803和AGS细胞,利用流式细胞术检测不同浓度Bufalin处理条件下,细胞死亡率的变化情况。3.利用荧光显微镜观察Bufalin处理后细胞核的变化特征,是否与细胞凋亡时细胞核的特征改变有区别。4.通过透射电镜观察细胞经不同处理后,细胞超微结构的改变情况,进一步区分细胞死亡时的形态学特征。5.利用流式细胞术,检测NEC-1与z-VAD-fmk对Bufalin诱导细胞死亡过程中的影响。6.通过Western blot技术检测不同处理因素下RIP3蛋白的表达水平的变化。7.利用流式细胞术及激光共聚焦技术检测RIP3下游信号分子MLKL是否参与Bufalin诱导发生的坏死性凋亡及其在细胞中的定位改变。结果:1.Bufalin对三种胃癌细胞的生长具有抑制作用。2.三种细胞的死亡率随着Bufalin浓度的升高而升高,证实Bufalin是以浓度依赖的方式诱导胃癌细胞死亡。3.Bufalin处理后,可见三种细胞在该药物浓度下无明显细胞凋亡时的特征改变。4.细胞经过Bufalin刺激后,胃癌细胞表现出细胞坏死时的特征改变,并且这种改变可以被NEC-1抑制剂所抑制。5.在特殊Bufalin浓度条件刺激下,三种胃癌细胞死亡的主要方式为坏死性凋亡,并且NEC-1可以明显抑制Bufalin所诱导的坏死性凋亡。6.RIP3参与了Bufalin刺激下诱导的坏死性凋亡的发生,该过程伴随RIP3表达量的升高,并且NEC-1可以使RIP3的表达量降低。7.RIP3下游信号分子MLKL参与了Bufalin诱导发生的坏死性凋亡,并且在刺激因素的存在下转位于细胞膜。结论:本研究扩展了Bufalin杀伤肿瘤细胞的分子机制:首次提出Bufalin可以诱导胃癌细胞发生坏死性凋亡;揭示坏死性凋亡关键分子RIP3及其下游信号分子MLKL参与了Bufalin诱导的胃癌细胞坏死性凋亡。