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猪II型圆环病毒(PCV2)是近年来发现的动物病毒之一，该病毒与猪的多种疾病综合症有关，特别是仔猪断奶后多系统衰竭综合症。该病最早于1991年在加拿大西部发现，病原学及血清学调查表明在许多国家都广泛存在，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明在主要的几个开放阅读框中，ORF1相对保守，主要编码病毒的复制蛋白，而ORF2相对变异较大，是主要的免疫原性基因，也是PCV2亚单位疫苗研制的主要对象。为了了解PCV2在我国的流行现状以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防治，本课题对PCV2基因工程疫苗进行了探索研究，主要研究内容如下：
以河南省猪圆环病毒阳性仔猪的脾脏为材料，提取病毒DNA，根据已报道的PCV2序列设计合成2对引物，应用PCR技术，扩增出猪圆环病毒野毒株ORF2基因和去信号肽基因命名为CORF2，然后将其克隆于pUCm-T载体中，构建克隆载体pUCm-T/CORF2，pUCm-T/ORF2，并进行核苷酸序列测定。
1.对CORF2，ORF2基因进行序列分析后，分别酶切pUCm-T/CORF2，pUCm-T/ORF2得到ORF2和CORF2基因，与原核表达载体pET-32a(+)、pET-41a(+)相连，构建重组质粒pET-32a/CORF2、pET-41a(+)/ORF2。
2.重组质粒pET-32a/CORF2，pET-41a(+)/ORF2转入宿主菌BLgold(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测蛋白表达情况及表达蛋白活性。结果表明重组质粒pET-32a/CORF2能在大肠杆菌中高效表达，其表达的蛋白以包涵体形式存在，表达产物的分子量为38KD左右，与理论推测的蛋白分子量一致。EWestern-blotting及建立的间接ELISA方法检测，表达的ORF2蛋白可被猪圆环病毒阳性血清所识别。pET-41a(+)/ORF2也能在大肠杆菌中表达，表达效果不是很好，经换载体与表达菌后仍不能高效表达，最后放弃。
3.收集重组质粒pET-32a/CORF2诱导表达的菌液，超声波破碎分离包涵体，TritonX-100和NaCl分别洗涤包涵体，用8mol/L尿素溶解包涵体后经Ni-BPA亲和层析法纯化，获得了纯度较高的目的蛋白，其纯度可达80％。每孔以100ng纯化的目的蛋白包被酶标板进行ELISA检测，结果显示，纯化蛋白与PCV阳性血清发生特异性反应。
4.表达产物经纯化后，以每只小鼠0.1mg、0.2 mg、0.4mg分成3组分别免疫5周龄左右的雌性小鼠，然后用ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体以及中和抗体的产生情况，结果表明，纯化的重组蛋白能使小鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体，从第7天开始产生抗体，第28天抗体水平达到最高，抗体可维持7周以上，并具有良好的安全性，为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础。