论文部分内容阅读
FAM3A是蛋白质序列相似度为3的细胞因子家族成员之一,它在肝脏中受到PPARG调控,参与脂肪代谢。本实验旨在研究FAM3A在前体脂肪细胞中的转录调控机制及其在脂肪细胞分化过程中的调控作用。主要研究结果如下：1.在3T3L1细胞中过表达C/EBPbeta,检测FAM3A基因表达量变化,发现C/EBPbeta能促进FAM3A表达(P<0.01)。2.构建FAM3A启动子缺失双荧光报告载体D1(-1478/+46)、D2(-1187/+46)、D3 (-951/+46)、D4 (-442/+46)、D5 (-285/+46)和D6 (-32/+46),分别转染3T3L1、C2C12和CHO三种细胞,检测荧光活性,结果FAM3A启动子各缺失在三种细胞中都有活性且有相似活性趋势,D5(-285/+46)活性最高,D6(-32/+46)活性最低,只有基本启动子活性。由此推断核心启动子位于-32bp至+46bp区域,-285bp至-32bp区域是启动子正向调控元件富集区,而-1478bp至-285bp区域分布着较多的抑制启动子活性的元件。3.将C/EBPbeta真核表达载体与FAM3A启动子各缺失共转染,FAM3A启动子各缺失活性显著增强(P<0.01),其中C/EBPbeta对缺失片断D-118,7/+46的作用最显著(P<0.01),将D-1187／+46活性提高了3.55倍。继续将启动子上C/EBPbeta结合位点定点突变并与C/EBPbeta真核表达载体共转染3T3L1细胞,结果突变启动子活性几乎不受C/EBPbeta影响。接着应用EMSA实验进一步证明C/EBPbeta蛋白能与启动子上C/EBPbeta结合位点结合。4.构建FAM3A真核表达载体并转染3T3L1细胞,用MDI诱导3T3L1细胞分化,结果该细胞成脂分化效率受到FAM3A抑制,分化8天后甘油三脂含量显著降低。检测脂肪分化标志基因表达情况,发现同对照组相比,PPARG2和FABP4在FAM3A基因在细胞分化2天后表达量显著下调(P<0.05),C/EBPα/SCD1、 DGAT1、LPL和FABP4基因在分化8天后下调表达,并达到显著水平(P<0.05)。FAM3A基因在3T3L1细胞分化8天后对HSL、ACC2、AdipoR1、FAS, ACOX1和UCP2基因表达没有影响。5.将FAM3A真核表达载体转染3T3L1细胞,72小时后收集细胞测定细胞周期,结果实验组的G1期细胞数量从63.5%上升到72.7%,同时S期占的细胞比例从24.8%下降至18.3%,两组细胞的G2期细胞数量没有显著差异,表明FAM3A能抑制3T3L1细胞周期。