论文部分内容阅读
在食品加工过程中美拉德反应容易产生以糖基化(Advanced glycation end products,AGEs)终产物为代表的多种潜在危害物。羧甲基赖氨酸(Carboxymethyl lysine,CML)是目前结构研究较为清楚的一种AGEs标志物,广泛存在于食品中,因此人类有面临暴露高浓度食源性CML的风险。目前,CML对身体健康的危害研究仍处于原始数据积累阶段,且食源性CML的体内毒性作用机制数据匮乏。借助二维细胞(Two-dimensional,2D)培养和动物模型进行人体组织结构及功能与病理研究是目前科学工作者常用的手段之一。2D细胞模型与人体组织三维(Three-dimensional,3D)结构的差异,导致实验研究的体系环境与生物体内的实际环境存在较大差异,如细胞与细胞间交流、细胞与基质间的相互作用、细胞分化等。由于种属差异,动物模型亦不能很好的重现人体特征,例如人类肿瘤生长转移、药物治疗反应、免疫反应等。因此,本研究拟采用人脑血管内皮细胞(Human brain vascular endothelial cells,HBVEC)构建体外3D微血管网络模型,研究CML对人脑血管的损伤作用及机制。方法将HBVEC细胞与水凝胶共培养,将其灌注于微流控芯片中构建3D微血管网络模型,用激光共聚焦显微镜拍摄微血管网络的形成过程。验证3D细胞模型的流动性。将HBVEC细胞分为五组,分别加入CML终浓度为0.00 mg/mL,0.05 mg/mL,0.1 mg/mL,0.2 mg/mL,0.5 mg/mL的细胞培养液染毒。24 h染毒结束后,采用CCK-8法测定CML对HBVEC细胞存活率的影响;利用GSH-Px和ROS试剂盒测定CML对HBVEC细胞氧化损伤状况;通过实时荧光定量PCR测定IL-6,TNF-α、VCAM、MCP-1、RAGE、AP-1、NF-κβ与p38mRNA表达上下调情况。结果1.与2D细胞模型相比,3D细胞模型更能真实模拟体内细胞间的微环境,3D细胞模型在评价CML对HBVEC细胞毒性作用时具有良好的重现性和稳定性。2.CML对HBVEC细胞有着一定的毒性作用,同时会造成细胞的氧化损伤。细胞活性随着CML浓度增大而降低,最终活力降低了14%。ROS随着CML浓度增大而增大,最大增长了71%。CML对GSH-Px活力也有所影响。3.CML可能对脑血管造成氧化损伤,从而破坏血脑屏障进入大脑。通过荧光定量检测相关基因的表达结果显示P38基因上调等异常,说明CML可以促进P38等炎症因子的mRNA表达。结论利用HBVEC成功构建了3D微血管网络模型,并利用该模型成功模拟了CML在人组织中的迁移和转运。研究发现,CML能够通过诱导机体氧化应激和免疫应答反应致人脑血管内皮细胞损伤造成炎症效应,同时对细胞有着明显的毒性作用。