研究背景肺癌是致死率高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌(NSCLC)大约占肺癌类型的80%。2004年,人们发现在NSCLC中存在表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶结构域的突变,且大多数突变阳性的患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如吉非替尼及厄洛替尼等敏感。接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变阳性的NSCLC患者中位生存期较化疗明显提高。然而,即使存在EGFR敏感突变,其中仍有20-30%的患者对EGFR-TKI原发性耐药,且治疗有效的患者不可避免的会产生获得性耐药。目前,有关EGFR-TKI获得性耐药的机制研究较多,如EGFR看守基因的二次突变(T790M)(约占50%)、MET扩增(约20-25%)、肝细胞生长因子(HGF)高表达及向小细胞肺癌转化等。但有关原发性耐药机制研究相对滞后。Bim基因是Bcl-2家族促凋亡成员之一。有研究发现,Bim基因的表达状态可能与EGFR突变阳性患者对EGFR-TKI的疗效存在相关性,但Bim基因的表达调控机制不明。人抗原R(HuR)是胚胎致死视觉异常(ELAV)家族的RNA结合蛋白,它可调节多种分子mRNA的稳定性,如cyclin A、cyclin B、TNF-α、IL-6和IL-8等。HuR都是通过与靶基因的3’UTR端ARE元件结合,调控靶基因mRNA稳定性及蛋白的表达。我们分析Bim基因的mRNA序列后发现,其3’UTR端含有多个AU元件,具备与RNA结合蛋白相互作用的分子基础。因此,我们推测作为RNA结合蛋白之一的HuR可能会调控Bim表达。研究目的研究HuR与Bim在NSCLC中的表达与EGFR-TKI药物敏感性的关系,对HuR通过调控Bim表达影响EGFR突变阳性的肺腺癌细胞株对EGFR-TKI原发耐药进行深入的研究,以期为临床判断EGFR-TKI药物治疗效果及克服耐药提供理论依据。研究方法1、免疫组织化学法检测HuR和Bim蛋白在EGFR突变阳性NSCLC组织中的表达(54例临床评价敏感和27例临床评价原发耐药),并分析肿瘤HuR与Bim表达、临床病理特征间的关系,进一步亚组分析EGFR-TKI敏感患者中HuR、Bim表达与PFS之间的关系。2、以H1650、HCC827及PC-9肺癌细胞为主要体外模型,给予吉非替尼药物处理后,用CCK-8法检测三种细胞的增殖情况。3、应用Western blotting、定量RT-PCR方法检测三种细胞HuR、Bim mRNA和蛋白水平的表达。4、在HCC827细胞中用siRNA干扰HuR表达,用吉非替尼药物处理后,用CCK-8、Annexin V/PI双染色法检测干扰组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC 50值。5、Western blotting和定量RT-PCR分别检测HCC827细胞干扰组及对照未干扰组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,以明确干扰HuR对Bim的影响。6、构建过表达HuR的慢病毒载体,包装病毒,随后感染H1650细胞;用CCK-8、Annexin V/PI双染色法检测感染组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC 50值。7、Western blotting和定量RT-PCR分别检测H1650细胞感染组及对照组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,体外分析高HuR水平对H1650细胞Bim表达的影响。8、用Balb/c小鼠,建立高表达HuR的H1650细胞皮下移植瘤模型,并观察吉非替尼药物处理后移植瘤生长情况,分析高HuR水平对EGFR-TKI药物敏感性的影响。9、RT-PCR及Western blotting检测移植瘤HuR、Bim mRNA和蛋白表达情况。10、免疫组化染色检测H1650移植瘤、对照组移植瘤中HuR及Bim表达情况。结果1、临床评价敏感组及原发耐药组NSCLC患者在性别方面存在显著差别(p=0.01),耐药组女性患者占18.5%,敏感组女性患者占57.4%。敏感组及耐药组在年龄、PS评分、突变类型、pTNM分期、是否有既往手术史、化疗史及是否存在脑转移等方面未见明显差别。2、在原发耐药组患者中,胞浆HuR阴性表达占81.5%;在敏感组患者中,阴性表达占20.4%;两组间表达率存在显著差异(p<0.001),耐药组患者HuR阴性表达率显著高于敏感组患者。同样,在原发性耐药的NSCLC患者中,Bim阴性表达占70.4%;在敏感组患者,阴性表达占7.4%;两组间表达率存在差异(p<0.001),耐药组患者Bim阴性表达率显著高于敏感组患者。3、在耐药组的患者中,胞浆HuR阴性表达与Bim阴性表达呈正相关(p<0.01);Bim表达与患者年龄、性别及突变类型不相关。4、在敏感组患者中,Bim阳性表达患者PFS为12.8个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,Bim阳性组PFS显著高于阴性组(p<0.01)。5、在敏感组患者中,HuR阳性表达患者PFS为16.5个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,HuR阳性组中位PFS显著高于阴性组。6、PC-9、HCC827及H1650细胞株对吉非替尼药物的细胞毒性实验结果发现:三种细胞的IC50值分别为0.05μml/L、0.004μml/L及21.28μml/L,三者比较前两种细胞对吉非替尼高度敏感,H1650细胞则对吉非替尼表现为耐药(p<0.01)。7、RT-PCR分析发现在三种肺癌细胞株中,HuR及Bim表达量存在差异,其中在H1650细胞株中HuR、Bim mRNA表达显著低于另外两株细胞(p<0.01);Western blotting结果显示,在H1650细胞株中HuR及Bim蛋白表达显著低于另外两株细胞株。8、我们利用小干扰RNA对高表达HuR的HCC827细胞进行瞬时转染,转染后行吉非替尼药物毒性试验,结果发现HCC827未干扰组其IC50值为0.004μM,干扰组为8.142μM,干扰组细胞表现出对吉非替尼耐药。两组细胞给予吉非替尼药物处理后行细胞凋亡检测发现,HCC827细胞干扰组凋亡率较对照未干扰组降低(p<0.05)。9、RT-PCR检测结果提示HCC827干扰组细胞HuR mRNA表达量低于未干扰组(p<0.01);Western blotting结果显示干扰组HuR蛋白表达显著低于未干扰组。我们对HCC827细胞Bim mRNA及蛋白进行检测,RT-PCR结果发现干扰组Bim mRNA表达明显低于未干扰组(p<0.01),Western blotting结果显示蛋白表达干扰组低于未干扰组。10、我们构建了过表达HuR慢病毒表达载体(GV365-HuR),转染H1650细胞后获得稳定过表达HuR的H1650细胞株。11、过表达HuR的H1650细胞株及对照组细胞分别给予吉非替尼处理,CCK-8法测定结果发现IC50值分别为0.875μM、21.28μM(p<0.01),提示过表达HuR增加了NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性。细胞凋亡结果提示,过表达HuR的H1650细胞凋亡率较对照组显著升高(p<0.01)。12、RT-PCR结果提示,过表达HuR的H1650细胞HuR及Bim mRNA表达量显著高于对照组(p<0.01);Western Blotting结果显示HuR及Bim蛋白表达水平也显著高于对照组。13、动物实验结果显示,过表达HuR的移植瘤经吉非替尼处理后,与对照组比较肿瘤生长明显受到抑制。处死小鼠后发现,过表达HuR的移植瘤体积及重量显著低于对照组。14、免疫组化结果显示,过表达HuR移植瘤肿瘤胞浆HuR阳性、Bim阳性均高于对照组。15、RT-PCR及Western blotting结果显示过表达HuR移植瘤HuR和Bim表达水平显著高于对照组。结论证实Bim基因表达下调是引起EGFR突变型NSCLC对EGFR-TKI天然耐药的重要因素,同时确定HuR通过调节Bim表达,导致耐药。