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谷胱甘肽(L-Glutathione)是细胞内含量最多的非蛋白类巯基化合物,由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸缩合形成的具有生物活性的三肽。在医药、食品和化妆品等行业有着广泛的应用。目前谷胱甘肽的的工业生产主要是通过酵母等微生物发酵,本文的主要研究内容是克隆表达来源Listeria monocytogenes的谷胱甘肽双功能合成酶GshF,进行酶学性质的研究,并克隆表达来源E.coli K-12的多聚磷酸激酶PPK,用于酶催化合成ATP,利用谷胱甘肽双功能酶和多聚磷酸激酶进行酶催化合成谷胱甘肽。首先,设计引物克隆获得Listeria monocytogenes的谷胱甘肽双功能酶基因,连接到pET28a(+)载体,构建重组表达载体pET28a(+)-gshF,以E.coli BL21(DE3)作为表达宿主,对其诱导表达重组蛋白的条件进行了优化,确定了表达重组蛋白的最优条件：在对数生长中期,调整培养温度到28℃后加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG进行诱导,摇瓶中GshF的最高酶活力可达2318 U/L。利用重组表达蛋白带有的His标签,对其进行Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的GshF的比酶活达14.68 U/mg,是粗酶的15.1倍,酶活回收率76%。并研究GshF的酶学特性：GshF催化反应的最适温度为37℃,最适pH为8.5,催化最适的ATP和Mg2+浓度为10 mmol/L和30 mmol/L,过量ATP对酶活反而有抑制作用。在37℃条件下,该酶的半衰期约为3h。最后用该酶进行体外催化合成GSH, GSH终产量为2.58g/L以甘油为碳源,对大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a(+)-gshF进行扩大培养,采用补料-分批发酵的方法,最终发酵OD600达86,外源蛋白GshF表达量达5.6g/L。设计引物克隆来自大肠杆菌的多聚磷酸激酶基因ppk,成功构建了重组大肠杆菌表达体系BL21 (DE3)/pET28a(+)-ppk,对其进行IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的PPK比酶活达2.6 U/mg,酶活回收率41%,利用PPK催化ADP生成ATP,反应平衡时ATP:ADP=1:0.77, ADP的转化率达到42%。以PPK为基础的ATP再生体系与谷胱甘肽合成酶GshF一起用于酶催化谷胱甘肽,在初始5 mmol/L的ADP和5 mmol/L polyP下,经过3小时的反应,GSH最终产量为4.5mmol/L (1.38g/L)。