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目的: 筛选肾阳虚证差异表达小RNA(microRNA,miRNA),构建肾阳虚证特征miRNA关联网络,分析网络中核心miRNA在肾阳虚证中的调控关系,从基因的miRNA转录后调控角度研究肾阳虚证的发病机制。 方法: 选择14例肾阳虚证患者和10例健康者作为研究对象,分别抽取外周血5ml,分离血白细胞,提取白细胞总RNA进行样品标记和芯片杂交,根据倍数分析法筛选肾阳虚证差异表达miRNAs;采用MirBase软件预测差异表达miRNAs的靶基因,DAVID软件进行靶基因GO分析和KEGG分析,并根据基因功能模块分析,反向交集miRNAs靶基因,筛选肾阳虚证的核心调控miRNAs;进而应用Cytoscape软件构建肾阳虚证相关miRNAs调控网络,关联网络中的核心miRNA-靶基因调控对,并分析miRNA调控对与肾阳虚证证候特征之间的调控关系。 结果: 1.差异表达miRNAs筛选结果 共筛选出48条肾阳虚证相关差异表达miRNAs,其中29条表达上调,19条表达下调。 2.差异表达miRNAs靶基因预测结果 靶基因大于50条(预测分大于90分)的差异miRNAs有5个,其中miR-3074的靶基因为97条,miR-5009的靶基因为73条,miR-4522的靶基因为76条,miR-136的靶基因为66条,miR-4536的靶基因为64条。 3.miRNA靶基因功能分析结果 (1)差异表达miRNAs靶基因在分子功能、细胞成分、生物学过程三个方面,分别注释到64、56和47个GO功能类别(P<0.05),其功能可划分为4个模块,其中模块1(miR-5009调控的靶基因群)中的靶基因功能主要涉及能量代谢相关,模块 2(miR-4522调控的靶基因群)中的靶基因功能主要涉及水液代谢相关,模块 3(miR-3074调控的靶基因群)中的靶基因功能主要涉及免疫调节相关,模块4中的靶基因功能较为广泛,主要涉及细胞间信号传导相关。 (2)差异表达miRNAs靶基因注释到96条KEGG分子通路,其中24条与免疫调节功能相关,19条与能量代谢功能相关,16条与水液代谢功能相关。 4.差异miRNA-靶基因功能网络关联分析结果 (1)在miRNAs-靶基因的调控网络中,有5个miRNAs(miR-3074、miR-4536、miR-4522、miR-136、miR-5009)处于网络的核心节点位置,其中miR-3074调控多个免疫功能相关基因,miR-4522调控多个水液代谢相关基因,miR-5009调控多个能量代谢相关基因。 (2)在miRNA-靶基因调控网络中,一个靶基因受多个miRNAs调控,每个miRNA调控着多个靶基因,miRNA与其靶基因构成了一个巨大的调控网络,在网络中关联基因TLR2、SOS、STAT3、JAK1、MyD88处于靶基因网络的核心节点位置。 结论: 1.miRNAs对基因的转录后调控异常可能是肾阳虚证多功能稳态失衡的重要调控机制之一。 2.肾阳虚证5个miRNAs(miR-3074、miR-4536、miR-4522、miR-136、miR-5009)与关联靶基因TLR2、SOS、STAT3、JAK1、MyD88构成了多层调控网络对。在调控网络中,5个miRNAs与肾阳虚证的发生密切相关,可能是肾阳虚证免疫功能失衡、能量代谢低下及水液代谢失调等功能紊乱的重要miRNA调控因子。