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本实验室白海洋微生物中筛选出一株产羧酸酯酶的芽孢杆菌(Bacillus MP-2),并对其产酯酶条件进行了优化。在此基础上,本实验以海洋芽孢杆菌酯酶为研究对象,对其进行了分离纯化及酶学性质方面的研究;以壳聚糖为材料制备了冻干-PVA-壳聚糖固定化酶,并对其在农药降解和手性拆分等领域的应用做了系统的探索。
海洋芽孢杆菌酯酶发酵液通过离心(10000r/min、4℃、30min)、50KDa滤膜超滤后得到粗酶液;粗酶液经硫铵分级沉淀、Phenyl Sepharose FF疏水层析、OSepharose HP阴离子交换层析、SuperdexTM200凝胶柱层析、冻干等技术,最终得到电泳纯的酯酶。SDS-PAGE电泳结果表明,该酯酶表观分子量为71KDa。以α-乙酸萘酯为底物对酯酶进行了理化性质的初步研究,结果表明:酯酶的最适反应温度为50℃,最适pH值为8.0,属于热稳定性良好的碱性酯酶。
以壳聚糖、聚乙烯醇(PVA)、戊二醛等为材料,利用吸附、交联的原理,通过冻干技术制备了冻干-PVA-壳聚糖固定化酯酶。并通过单因素优化实验,确定了固定化酶生产的适宜条件:壳聚糖浓度3%、PVA浓度3g/L、酶液固定化载体体积质量比5/2ml/g,戊二醛浓度0.4%,交联时间30min,此时固定化酶活力回收率为73.8%。酯酶经固定化后,热稳定性和抗酸碱能力有明显提升;在60℃,pH7.0的反应体系中活性最大;使用5次后,固定化酶找体形状基本没变化,活性保留了71%。
利用冻干-PVA-壳聚糖固定化酯酶来降解农药西维因,并通过正交试验,得出了降解反应的最佳条件,即在pH7.0、温度60℃、加酶量0.4g、反应70min时,固定化酶对西维因的降解率达到最大值83.4%。在酯酶降解西维因的反应体系中,加入不同的金属离子,会对降解率有所影响,其中,K+、Ca2+对降解反应有一定的促进作用,而Ag+、Fe3+的抑制作用最为显著。
利用冻干-PVA-壳聚糖固定化酯酶水解D-泛解酸内酯、用HPLC对反应过程进行监控,并通过单因素试验对水解反应条件进行了优化,得出了最适水解条件:搅拌速率150r/min,固定化酶5g、反应时间6h,反应温度40℃,在此条件下,D-泛解酸内酯的水解率达到最大值21.08%。在此基础上,研究了固定化酶对L-泛解酸内酯的水解反应和DL-泛解酸内酯的拆分反应,在最适条件下,L-泛解酸内酯的水解率<1.0%;DL-泛解酸内酯的底物水解率为10.03%,产物对映体过量值(e.e-%)为92.57%。
本研究成果为海洋芽孢杆菌MP-2酯酶在农药降解及手性拆分领域中的应用奠定了一定基础,因而在经济、社会和学术研究等方面具有重要意义。