研究背景我国心血管疾病的发病率和死亡率位居前列,而动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病重要的病理基础,是一个多种因素参与,慢性、进行性发展的病理过程。血管内皮细胞是位于血液和血管内膜下组织之间的一层单层细胞,能合成与分泌多种细胞因子,参与调节胆固醇和脂质平衡、血液凝固及纤溶、信号转导、免疫炎症等多项生理过程,血管内皮细胞损伤是AS的始动环节,血管内皮受损结构和功能出现障碍是AS起始的最敏感指标之一。近年来,多项研究提示microRNA表达和功能异常在AS进程中发挥重要调节作用,生物芯片检测发现在内皮损伤、血管修复过程中有一系列microRNA表达发生变化,在循环中检测到某些microRNA表达变化可以作为心血管疾病发生的标记物。MicroRNA是一类大约20～25个核苷酸大小的短链非编码RNA,广泛表达于机体内各种类型的细胞,是机体重要的转录后调节基因,参与机体多种生理和病理活动的调节。MicroRNA可参与多项生理功能如增殖、分化、发育、脂质代谢、血管发生、肿瘤发生、细胞死亡等的调节。MiR-126是血管内皮细胞特异microRNA,可以调节血管生成及血管重建。先前报道miR-126可抑制血管内皮粘附分子1 (vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)表达及单核细胞迁移黏附至内皮上发挥抗AS作用,另外也有临床研究报道miR-126有辅助鉴别诊断心血管疾病的作用。但是miR-126对于血管内皮细胞损伤调节的具体分子机制还不是很清楚。过多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)蓄积在体内是一种重要的促AS发生发展的因素,ROS可以通过促进细胞凋亡、诱导黏附分子表达损伤内皮细胞,ROS的生成与多种因素有关,沉默信息调节因子2(Silent information regulator 2 protein, Sirtuins)蛋白是一类依赖(NAD)的组蛋白去乙酰基转移酶,有研究发现棕榈酸诱导的肾小管细胞损伤中,ROS生成增加,过表达SirT3时可减轻棕榈酸诱导的ROS生成过多,减轻炎症反应。除了Sirtuins蛋白可以调节线粒体内活性氧生成以外,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADPH)氧化酶也是血管内一种重要的促进活性氧生成的氧化酶类,棕榈酸可促进动物模型中的内皮ROS生成增多,而NADPH氧化酶抑制剂可以减轻棕榈酸的诱导效应。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是一种在炎性疾病病理过程中释放的炎性因子,在AS内皮损伤中也发挥重要作用,研究提示TNF可以促进内皮细胞ROS生成增加、氧化应激水平提高及细胞凋亡。肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factors, TRAFs)可以和肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)结合,是TNF超家族重要的接头分子,在免疫应答、胚胎发育、应激反应中发挥重要功能。TRAF家族有7个成员(TRAF1-7), TRAF7是近年来新发现的TRAF家族,TRAF7的功能还不是很清楚,但已知其可以与c-Myb结合促进其类泛素化继而抑制其活性,也可以结合并激活MEKK3家族。还有研究显示TRAF7参与到TOLL样受体家族信号转导中并激活NF-kB通路,TRAF2,-5及-6均可激活NF-kB通路,激活NF--κB抑制蛋白(inhibition nuclear factor-kappa B, IkB)激酶复合体,导致IkBa的降解,p50/p65转录复合体核转位,从而激活多种与细胞生存、免疫炎症反应有关的基因表达,但是关于TRAF7在棕榈酸诱导的内皮损伤中的作用还不是很清楚。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)与NADPH氧化酶的激活有关,人肺血管内皮细胞中过表达MLCK可以激活NADPH氧化酶促进ROS生成增多。MLCK可以磷酸化肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC), MLC是一种细胞骨架蛋白,其磷酸化水平升高可引起内皮细胞骨架重排,导致内皮细胞收缩加强,动脉内膜屏障的完整性被破坏,内膜通透性增加,从而使脂质更容易浸润至内膜下促进AS病程发生发展。本研究主要探讨miR-126对棕榈酸诱导的内皮细胞损伤的调节作用,发现miR-126可以减少棕榈酸诱导的细胞凋亡、活性氧产生及炎性细胞因子TNF-a表达,并且调节棕榈酸诱导的内皮细胞损伤中NADPH氧化酶、SirT3蛋白的表达水平。miR-126可减轻棕榈酸诱导的内皮细胞运动,并调节相关蛋白MLCK.MLC、 MYPT1的表达,通过双荧光素酶报告基因实验和实时定量PCR及Western blot检测证实TRAF7是miR-126的靶基因,并发现miR-126可能通过MAPK信号通路的活性发挥调控作用。通过本课题的研究,希望为下一步进行动物实验提供基础数据。目的通过本课题研究miR-126对棕榈酸诱导的HUVEC的细胞凋亡、caspase3活性、ROS产生、炎性细胞因子TNF-a表达、NADPH氧化酶及SirT3蛋白的表达、细胞运动及骨架蛋白的影响,并探讨其中可能的作用机制,以明确miR-126对HUVEC的保护作用,并检测TRAF7是否为其靶基因,揭示miR-126发挥作用的可能分子机制。方法分别用0.1mM棕榈酸、0.1mM油脂酸作用于人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,采用miRNA plate assay kit检测棕榈酸对于HUVEC miR-126表达水平的影响。将miR-126模拟物、抑制剂及阴性对照物转染到HUVEC中,niRNA plate assay kit检测细胞miR-126的表达水平,明确转染实验有无成功。用Cellular DNA Fragmentation ELISA、流式细胞术检测miR-126模拟物及抑制剂对于棕榈酸诱导的细胞凋亡的影响,并分别检测miR-126模拟物及抑制剂对于棕榈酸诱导的HUVEC Caspase-3活性、TNF-a表达及ROS产生的影响。Western blot检测miR-126模拟物及抑制剂对于棕榈酸诱导的HUVEC的NADPH氧化酶p67phox、Racl亚基及SirT3蛋白表达的影响。细胞划痕实验检测miR-126对于棕榈酸诱导的内皮细胞迁移的影响,Western blot分析miR-126对于棕榈酸作用下HUVEC细胞MCLK蛋白表达的变化,MLC、 MYPT1磷酸化水平的影响。进一步预测miR-126靶基因TRAF7,并构建包含野生型TRAF73’UTR和突变体TRAF73’UTR的Luciferase报告基因载体,检测miR-126对于TRAF7的直接调控作用,Western blot、qPCR分析TRAF7表达的变化。Western blot分析miR-126对于MAPK通路蛋白磷酸化水平的影响。结果1.棕榈酸减少HUVEC中miR-126的表达。通过miRNA plate assay检测发现与用油脂酸刺激的HUVEC相比,棕榈酸组的HUVEC中miR-126表达水平明显减少。2.棕榈酸可以促进HUVEC凋亡、ROS生成增多及Caspase-3活性增加,诱导TNF-a表达并增加TRAF7的蛋白表达,棕榈酸可增加]3UVEC中NADPH氧化酶p67亚基、Racl亚基表达,减少SirT3蛋白表达；3.MiR-126可减轻棕榈酸诱导的HUVEC细胞凋亡。转染成功后,通过细胞凋亡DNA片段检测miR-126对棕榈酸诱导HUVEC的凋亡的影响,发现与油脂酸组相比,棕榈酸诱导细胞损伤凋亡增多,而miR-126模拟物可减轻棕榈酸诱导的细胞凋亡,miR-126抑制剂则加强棕榈酸诱导的细胞凋亡。Caspase-3活性检测也得到相似结果。4.MiR-126可减少棕榈酸诱导的HUVEC细胞ROS的产生。ROS检测提示miR-126模拟物可减少棕榈酸诱导的细胞ROS产生,miR-126抑制剂则加强棕榈酸诱导的细胞ROS产生。5.MiR-126可降低棕榈酸诱导的HUVEC中NADPH氧化酶p67亚基、Rac1亚基表达,miR-126可上调棕榈酸诱导的HUVEC中SirT3蛋白表达。6.MiR-126可降低棕榈酸诱导的HUVEC培养上清TNF-a的表达。ELISA检测提示miR-126模拟物可减少棕榈酸诱导的HUVEC培养上清TNF-a的表达,miR-126抑制剂则增加棕榈酸诱导的HUVEC培养上清TNF-α的表达。7.棕榈酸可以促进HUVEC运动,而miR-126可减轻其对运动的影响。棕榈酸可以促进MLCK表达及升高MLC、pMYPT1磷酸化水平,而miR-126可下调MLCK水平并减少MLC、pMYPT1磷酸化水平。8.MiR-126对HUVEC中TRAF7的mRNA表达无影响,但可以减少TRAF7蛋白表达。实时定量PCR检测发现转染miR-126模拟物、miR-126抑制剂均对HUVEC中TRAF7的mRNA表达无影响。Western blot结果发现HUVEC转染miR-126模拟物后其miR-126表达水平上调,可减低HUVEC的TRAF7蛋白表达水平,miR-126抑制剂转染后其miR-126表达水平下降,增加HUVEC的TRAF7蛋白表达水平。Western blot结果发现棕榈酸可增加HUVEC的TRAF7蛋白表达水平。9. TRAF7是miR-126的靶基因。野生型TRAF73’UTR和突变体TRAF73’UTR的Luciferase报告基因载体构建成功,共转染miR-126模拟物和野生型报告基因载体后,萤光素酶活性明显降低,转染miR-126模拟物和突变型报告基因载体后,萤光素酶活性无影响;而共转染miR-126抑制剂和野生型报告基因载体后,萤光素酶活性增加,共转染miR-126抑制剂和突变型报告基因载体后萤光素酶活性无影响。10.MiR-126可下调ERK磷酸化水平。结论1.棕榈酸可以减少HUVEC细胞中miR-126的表达；2.棕榈酸能够诱导HUVEC细胞发生凋亡,而miR-126则可减轻棕榈酸诱导的细胞凋亡；3.MiR-126可改善棕榈酸诱导的HUVEC细胞活性氧产生及TNF-α表达。4.MiR-126可调节棕榈酸对HUVEC中NADPH氧化酶、SirT3蛋白表达的影响。5.MiR-126可改善棕榈酸诱导的HUVEC的运动,下调相关蛋白MLCK表达及MLC、MYPT1的磷酸化水平。6.MiR-126可下调HUVEC中TRAF7的蛋白表达,TRAF7是miR-126直接作用的靶基因。7.MiR-126对棕榈酸诱导的HUVEC的调控作用可能与MAPK信号通路的活性改变有关。