论文部分内容阅读
一、目的考察马钱子碱的P-糖蛋白(P-gp)底物特性,并探讨P-gp对马钱子碱在体外血脑屏障(BBB)转运的影响。二、方法1.体外血脑屏障模型的建立和评价采用同种属脑微血管内皮细胞(BMEC)和星形胶质细胞(As)共培养的方法,建立体外BBB模型。BMEC鉴定采用形态学观察、Ⅷ因子免疫细胞化学和P-gp免疫细胞荧光。As鉴定采用形态学观察和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学。BBB评价采用形态学观察、电镜观察、试漏试验、TEER值测定,以及荧光素钠和125Ⅰ-血清白蛋白(125Ⅰ-ALB)通透性试验。2.马钱子碱和P-gp体外亲和力研究采用P-gp ATPase分析方法,根据P-gp经底物诱导产生ATPase活性的原理考察药物和P-gp的体外亲和力。将系列浓度为0.01-1000μmol·L-1的马钱子碱与P-gp膜共孵育,考察P-gp的ATPase活性变化,钼蓝法测定P-gp外排药物时水解ATP释放的无机磷(Pi),米-曼式方程计算Vmax、Km、Vmax/Km。3.P-gp对马钱子碱在体外血脑屏障转运的影响MTT(苯基溴化四氮唑蓝)法考察马钱子碱(0.05-500μmol·L-1)和维拉帕米(0.1-100μmol·L-1)对BMEC及As的毒性,选择细胞存活率大于90%的药物浓度作为最大无毒浓度进行药物跨BBB转运试验。建立UPLC-MS/MS法测定马钱子碱,并进行方法学确证。在建立好的体外BBB模型上考察马钱子碱的双向跨膜转运,比较P-gp功能改变前后马钱子碱转运的差异,罗丹明123(Rh 123)作为阳性对照。UPLC-MS/MS测定样品中马钱子碱的浓度,计算表观通透系数Papp和外排率ER。三、结果1.体外血脑屏障模型的建立和评价BMEC呈现特征形态学,Ⅷ因子和P-gp表达呈阳性；As细胞呈现特征形态学,GFAP表达呈阳性。BMEC和As共培养模型显示出与单独培养时相似的形态学；电镜观察BMEC间存在紧密连接；试漏试验初步判断BBB已经形成；BBB模型呈现较高的跨内皮电阻(283.78±18.85)Ω·cm2；荧光素钠和125Ⅰ-ALB通透系数Papp分别为(10.36±0.86)×10-6 cm·s-1和(6.00±0.78)×10-6 cm·s-1,显示了BBB良好的细胞旁路限制通透性。体外BBB模型基本形成。2.马钱子碱和P-gp体外亲和力研究马钱子碱诱导的P-gp ATPase活性存在时间依赖性。相同浓度时,随着马钱子碱和P-gp作用时间的延长,ATP水解释放的Pi量增加。马钱子碱浓度和ATP水解时Pi的释放量呈现非线性关系。反应相同时间,随着药物浓度增加,Pi释放量增加。与维拉帕米(Vmax/Km: 2.9)相比,马钱子碱(Vmax/Km: 1.6)显示出中等强度的P-gp亲和力。3.P-gp对马钱子碱在体外血脑屏障上转运的影响24小时MTT毒性试验结果显示,马钱子碱对BMEC和As两种细胞的最大无毒浓度分别为500μmol·L-1和50μmol·L-1。在0.1-100μmol·L-1范围内,维拉帕米对两种细胞无明显毒性。选择马钱子碱系列浓度O.05.5.50μmol·L-1以及维拉帕米50μmol·L-1进行药物跨BBB转运试验。马钱子碱跨BBB转运试验结果显示：未加入P-gp抑制剂维拉帕米时,低、中、高浓度马钱子碱脑内侧-血液侧转运强于血液侧-脑内侧转运(P<0.05),ER值分别为1.32、1.56和1.54,低浓度时,马钱子碱的P-gp底物特征相对较弱。加入维拉帕米之后,低、中、高浓度的马钱子碱ER值均减小,与未加维拉帕米时具有统计学差异。提示,P-gp在一定程度上参与了马钱子碱在体外BBB的转运。四、结论1.本研究利用同种属BMEC与As共培养的方法,建立了一种简便可行的SD大鼠体外BBB模型。此模型在细胞形态、超微结构、限制通透性等方面都保留了良好的BBB的特性。2.马钱子碱具有中等强度的P-gp底物特性,P-gp在一定程度上参与了马钱子碱在体外BBB的转运。更确切的结果需要结合其他水平的研究进一步证实。