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抗菌肽是宿主防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的肽类物质,是宿主免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽不仅具有广泛的抗菌谱,而且有抑制癌细胞生长的作用及不易产生耐药性的特点,这使得抗菌肽开发利用成为近年来的研究热点。
从1980年瑞典科学家Boman在惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种抗菌肽Cecropin以来,已有一千多种抗菌肽被相继发现。抗菌肽主要来源于昆虫、蛙类、甲壳类、软体动物,哺乳动物以及人工合成。然而从天然中筛选抗菌肽需要经过一系列复杂生化分离过程,这样大大的延长了新抗菌肽发现的时间,制约了抗菌肽研究的进展。这样迫切需要利用基因工程技术建立一种快速筛选和验证抗菌肽的新方法。
本研究建立了一种以载体pET30a为基础,用自剪切蛋白NPRO为融合标签蛋白构建了一种快速筛选和验证未知抗菌肽的新系统。首先用生物信息学的BLAST的方法,得到一系列可能为抗菌肽的的氨基酸序列,然后将氨基酸序列设计合成以大肠杆菌标准密码子的编码基因,设计合成引物快速克隆到以自剪切蛋白NPRO为融合标签蛋白的表达载体上。融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在。融合蛋白质在体外复性,融合蛋白中NPRO自我准确剪切,形成原始N端的抗菌肽。以管碟法作为检测抗菌肽抑菌活性的标准方法,G+菌采用藤黄八叠球菌(Micrococcus luteus)为代表,G-以大肠杆菌(Escherichia coliATCC2592)为代表,真菌采用酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae ACCC20034)作为代表测试菌株,测定抗菌肽的抗菌活性。通过对补体c8基因进行生物信息的分析,推测其中有4个片段是疑似抗菌肽,然后采用该方法快速鉴别出这四种疑似抗菌肽有抗G+和G-细菌的活性。为快速筛选和验证抗菌肽提供了一种新的方法。