棉花抗黄萎病相关基因GhLAC的功能分析

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细胞壁是植物抵抗病原菌侵入的重要屏障,也是寄主与病原菌互作的重要场所。寄主植物细胞通过在细胞壁、胞间层、细胞质部位产生一系列抗性反应,如细胞壁木质化、胼胝质积累、伸展蛋白合成等途径阻止病原菌的再度侵染和蔓延。本研究通过对3个不同抗病棉花品种Pima90-53,冀棉20和邯208的接菌试验,研究细胞壁的组分含量和GhLAC的表达水平变化与棉花黄萎病抗性的关系;从冀棉20中克隆抗黄萎病相关基因GhLAC;研究GhLAC的超表达和基因沉默后,转基因拟南芥株系的细胞壁糖组分、木质素含量和木质素组分含量变化与植物抗病性的关系。主要结果如下:1、3个不同抗病棉花品种Pima90-53,冀棉20和邯208的酸不可溶性木质素含量与品种的病情指数呈显著负相关(r=0.99991*),与黄萎病抗性呈正相关。2、克隆获得漆酶GhLAC基因的ORF(gi: EU642559.1,1701bp)序列和基因组序列(2401bp)。该基因含有6个内含子,在二倍体雷蒙德氏棉的基因组中含有7个漆酶的同源基因,且均分布与9号染色体。3、GhLAC蛋白属于铜蓝氧化酶蛋白,定位于细胞壁。在接种黄萎病菌8h时,GhLAC在冀棉20中的表达量达到最高并在后续64h内一直维持较高水平,且在各检测时间点均显著高于对照邯208。4、构建完成GhLAC的超表达载体pGNLac、RNAi载体ipCamLac和融合表达载体pCamLacGFP,并获得转基因拟南芥pGNLac纯合株系6个,pCamLacGFP纯合株系12个,ipCamLacGFP纯合株系8个。5、GhLAC VIGS处理后的冀棉20病情指数为66.99,与空载体对照处理的棉花病情指数41.97表现为显著性差异;GhLAC的沉默增加了棉花对V. dahliae的敏感性。6、GhLAC的超表达增强了转基因株系对黄萎病的抗性,而GhLAC的RNAi降低了植株对黄萎病菌的抗性。接菌黄萎病菌后,超表达转基因拟南芥株系导管轻微堵塞,RNAi和野生型拟南芥的茎部疏导组织由导管堵塞严重。超表达株系中的株高、AIL含量、G型木质素单体(G-lignin)、S型木质素单体(S-lignin)和总木质素的含量均显著或极显著高于RNAi株系和野生型拟南芥。明确了GhLAC参与了木质素的生物合成途径,GhLAC在受到黄萎病菌侵染的转基因拟南芥中有利于维持G型木质素单体(G-lignin)的含量。7、构建了双元表达载体pCamE (gi: JX841315)。在该载体的启动子上游、多克隆位点和终止子下游分别含有4个、8个和3个单拷贝限制性内切酶位点,可用于不同基因和不同功能表达载体的快捷构建,并在宿主材料中稳定遗传。
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