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在牙周组织的局部炎症中,宿主细胞可分泌多种蛋白水解酶参与降解细胞外基质,导致牙周软组织破坏、牙骨质及牙槽骨吸收,严重时可导致牙齿脱落。在这些蛋白水解酶中,基质金属蛋白酶(MMPs)在牙周组织的破坏进展中起重要作用。基质金属蛋白酶是一组高度同源的锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶,具有独特的结构及催化特性,能够介导组织重塑和细胞外基质的降解。有研究指出在MMPs中,MMP-9是牙周病严重程度及病程进展的重要指标,其可降解变性胶原(明胶)及Ⅳ型胶原,与临床指标有着显著相关性。在正畸治疗中,机械力作用于牙周组织后,牙周组织相关细胞可通过分泌IL-1β、IL-6等炎性因子导致牙周组织产生炎症反应。值得注意的是,在牙菌斑生物膜中,细菌脂多糖或其他病原分子将宿主免疫细胞募集到菌斑处,并使这些细胞通过释放如IL-1β、TNF-α等参与炎症应答。这些炎性因子进一步引发一系列炎症反应促进牙周组织的破坏,同时还可与RANKL协同参与破骨细胞的激活、诱导牙周组织相关细胞分泌MMPs等。牙骨质是牙根表面的矿化结缔组织,其通过牙周韧带将牙根固定在牙槽窝中,因此确保牙骨质的完整对维持牙齿的稳定有重要意义。Ⅰ型胶原为牙骨质的主要有机成分,其胶原纤维不仅为无机矿物盐提供沉积的支架,而且还参与调控羟基磷灰石的成核等过程。成牙骨质细胞是位于牙骨质表面的功能细胞,可分泌胶原及非胶原蛋白,参与牙骨质的形成、修复与矿化,对维持牙骨质的代谢有重要作用。然而,作为降解胶原等基质的蛋白水解酶,MMPs在成牙骨质细胞中的表达却知之甚少。本研究拟探讨IL-1β对MMP-9在成牙骨质细胞中表达的影响及调控机制,以及探讨IL-1β对成牙骨质细胞介导胶原降解的影响,从而对牙周炎或正畸诱导的炎症中牙骨质的代谢提供一定的认识和理解。第一部分IL-1β对成牙骨质细胞中MMP-9表达的影响目的:探讨IL-1β对成牙骨质细胞中MMP-9表达的影响方法:(1)将OCCM-30细胞系以5×10~5/孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板,同时给予不同浓度的IL-1β(0、5、10、20、40ng/ml)处理24 h,采用明胶酶谱分析法检测及实时荧光定量PCR检测MMP-9的表达变化;(2)采用20ng/ml的IL-1β处理成牙骨质细胞不同时间(0、1、3、6、12、24 h),然后采用明胶酶谱分析法及实时荧光定量PCR检测MMP-9在时间上的表达变化;(3)同时采用IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)与IL-1β共同处理OCCM-30细胞,然后通过胶酶谱分析法检测MMP-9的表达变化以进一步明确IL-1β对MMP-9表达的影响;(4)采用TNF-α或IL-6/IL-6 R alpha处理细胞不同时间(0、1、3、6、12、24 h),然后采用实时荧光定量PCR检测MMP-9在时间上的表达变化。结果:(1)在IL-1β的处理下,成牙骨质细胞所分泌的pro-MMP-9(92KDa)表达显著上调;同时也可观察到activated-MMP-9及MMP-2,但未见其显著增加;(2)随着IL-1β作用于成牙骨质细胞的时间增加,细胞上清中pro-MMP-9的表达及细胞中MMP-9的mRNA表达也随之上升,且MMP-2的表达未有显著变化;(3)IL-1Ra(1000ng/ml)阻断了IL-1β对成牙骨质细胞中pro-MMP-9表达的上调;(4)TNF-α或IL-6/IL-6 R alpha作用于成牙骨质细胞后,细胞中MMP-9的mRNA表达升高,且呈时间依赖性。结论:IL-1β可诱导成牙骨质细胞pro-MMP-9的表达上调,且随作用时间的增加而上升,同时成牙骨质细胞中MMP-2的表达不受IL-1β的影响。第二部分IL-1β调控成牙骨质细胞中MMP-9表达的信号转导机制目的:研究IL-1β调控成牙骨质细胞中MMP-9表达的信号转导机制方法:(1)采用20ng/ml浓度的IL-1β作用于OCCM-30细胞,通过western blot、EMSA或荧光素酶报告基因检测ERK1/2、JNK、P38、c-Fos、c-Jun、ATF-2及AP-1信号分子;(2)采用特异性化学阻断剂U0126、SP600125、SB203580及tanshinone IIA预处理OCCM-30细胞,然后与IL-1β共同作用于细胞一定时间,通过明胶酶谱及实时荧光定量PCR检测MMP-9的表达变化;(3)采用特异性化学阻断剂U0126及SP600125预处理OCCM-30细胞,然后与IL-1β共同作用于细胞一定时间,通过荧光素酶报告基因检测转录因子AP-1的转录活性、通过western blot检测c-Fos及ATF-2蛋白活性以及通过实时荧光定量PCR检测c-Fos及c-Jun的mRNA表达。结果:(1)IL-1β作用于OCCM-30细胞后,western blot结果显示IL-1β可磷酸化激活ERK1/2、JNK、P38、c-Fos及ATF-2蛋白,且呈时间依赖性;EMSA结果显示IL-1β可增强AP-1蛋白结合活性;荧光素酶报告基因检测结果显示IL-1β可上调AP-1蛋白转录活性;(2)明胶酶谱及实时荧光定量PCR检测结果显示,特异性化学阻断剂U0126、SP600125及tanshinone IIA可一定程度上抑制IL-1β诱导OCCM-30细胞中MMP-9的表达;(3)荧光素酶报告基因检测结果显示,特异性化学阻断剂U0126及SP600125可在一定程度上抑制IL-1β上调的AP-1转录活性;western blot及实时荧光定量PCR结果显示,特异性化学阻断剂U0126可阻断IL-1β磷酸化的c-Fos蛋白并抑制IL-1β上调的c-Fos的mRNA表达;特异性化学阻断剂SP600125可阻断IL-1β磷酸化的ATF-2蛋白并抑制IL-1β上调的c-Jun的mRNA表达。结论:IL-1β通过激活ERK1/2信号通路磷酸化c-Fos和上调c-Fos的表达及通过激活JNK信号通路磷酸化ATF-2和上调c-Jun的表达来增加AP-1的蛋白活性,从而促进MMP-9在成牙骨质细胞中的表达。第三部分IL-1β对成牙骨质细胞介导胶原降解的影响目的:研究IL-1β对成牙骨质细胞介导胶原降解的影响方法:(1)采用20ng/ml浓度的IL-1β作用于OCCM-30细胞,通过western blot及实时荧光定量PCR检测MMP-13的表达;(2)在6孔培养板中包被Ⅰ型胶原后,接种50ul(约60,000个)OCCM-30细胞于孔板中,待细胞贴壁后采用IL-1β作用于细胞48 h、72 h及96 h,然后采用胰蛋白酶消化细胞并通过考马斯亮蓝染色检测胶原降解情况;(3)如上述步骤接种细胞于孔板,然后采用MMPs活性激活剂plasmin与IL-1β共同作用于细胞72 h,然后采用胰蛋白酶消化细胞并通过考马斯亮蓝染色检测胶原降解情况;(4)如上述步骤接种细胞于孔板,采用MMPs抑制剂BB-94与plasmin及IL-1β共同作用于细胞72 h,然后采用上述方法检测胶原降解情况;(5)采用20ng/ml浓度的IL-1β作用于OCCM-30细胞,通过western blot及实时荧光定量PCR检测TIMP-1及TIMP-3的表达。结果:(1)western blot及实时荧光定量PCR检测结果显示,IL-1β可上调OCCM-30细胞中MMP-13的表达,且呈时间依赖性;(2)在无MMPs激活剂的条件下,IL-1β对OCCM-30细胞介导的胶原降解并没有明显影响;(3)plasmin与IL-1β共同作用下,OCCM-30细胞介导的胶原降解显著增强;(4)MMPs抑制剂BB-94抑制了plasmin与IL-1β诱导的细胞介导的胶原降解(5)western blot及实时荧光定量PCR检测结果显示,IL-1β可上调OCCM-30细胞中TIMP-1及TIMP-3的表达,且呈时间依赖性。结论:在MMPs活性激活剂存在的条件下,IL-1β可通过上调MMPs的表达促进成牙骨质细胞介导的胶原降解;同时IL-1β还可上调TIMP-1及TIMP-3的表达,其可能在一定程度上负向调节IL-1β诱导的胶原降解。