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目的:肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis,RIF)是引起慢性肾脏病的最终共同途径,正常肾脏功能的维持依赖于20余种不同细胞之间的相互作用。在肾脏纤维化的时候,这种“复合结构”发生变化,细胞之间相互作用的平衡发生改变。其特征包括胶原纤维的积聚、肌成纤维细胞的激活、炎症细胞的活化以及微血管结构和上皮细胞的丢失。其中肾间质内细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的沉积是肾间质纤维化的主要特征,而肾间质的肌成纤维细胞是合成分泌ECM的主要细胞。目前研究认为肾小管上皮细胞向间充质细胞转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是肾间质肌成纤维细胞的一个重要来源。配对盒基因2(Paired box2,PAX2)编码核转录因子,在胚胎肾脏发育方面发挥调控作用。本课题组及近来的研究认为其可促进肾纤维化的发生,并诱导肾小管上皮细胞发生EMT。去整合素金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloprotease 10,ADAM10)具有金属蛋白酶活性,可促进多种细胞表面分子的成熟,目前发现在肾癌和黑色素瘤细胞中PAX2可以直接调控ADAM10的表达。因此本研究中采用PAX2诱导肾小管上皮细胞间充质转化(EMT),探讨此过程中对ADAM10表达的影响及其作用机制,并进一步研究ADAM10对肾小管上皮细胞EMT的影响以及其在纤维化肾脏组织中的表达情况,探讨PAX2致肾小管EMT的作用机制。研究方法:本研究细胞实验部分,构建PAX2慢病毒表达载体,转染大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E),检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和ADAM10的表达情况。同时应用染色质免疫共沉淀实验和双荧光素酶报告基因实验检测PAX2对ADAM10启动子转录活性的影响及其作用机制。ADAM10过表达真核质粒转染人近曲小管上皮细胞(HK-2)检测肾小管上皮细胞EMT指标E-cadherin和α-SMA的表达情况。在过表达PAX2的NRK52E细胞中加入ADAM10特异性抑制剂检测E-cadherin和α-SMA的表达情况。动物实验部分,选取雄性Wistar大鼠60只,随机分为假手术组和模型组各30只,各组大鼠分别在术后3d、7d、14d、21d、28d取6只,留取肾标本,观察肾组织病理变化,检测E-cadherin和α-SMA以及PAX2和ADAM10的表达情况。并进一步采用免疫组化方法和免疫荧光方法检测慢性肾脏病人留存的肾活检组织标本中ADAM10的表达情况。结果:1、PAX2慢病毒过表达载体转染NRK52E,结果显示与对照组比较,PAX2过表达组E-cadherin的mRNA及蛋白水平下调(P<0.05),α-SMA的mRNA及蛋白水平上调(P<0.05),提示细胞出现EMT的表型转化。同时Real-time qPCR、免疫印迹及免疫荧光的检测结果均提示PAX2过表达组ADAM10的mRNA和蛋白表达水平也上调(P<0.05),提示PAX2过表达可引起ADAM10的转录激活及表达增加。2、利用生物信息学软件Jaspar和PROMO预测ADAM10的转录起始点上游-281bp存在PAX2的结合位点,通过染色质免疫共沉淀实验确定了在肾小管上皮细胞内PAX2可以与ADAM10启动子上的结合位点直接结合(P<0.01),从而对ADAM10的转录发挥调控作用。3、利用双荧光素酶报告基因实验检测PAX2对ADAM10启动子转录活性的影响,结果提示大鼠肾小管上皮细胞中PAX2过表达组ADAM10启动子转录活性明显升高,是对照组的3.2±0.26倍(P<0.001)。4、ADAM10过表达质粒转染HK-2,Real-time qPCR、免疫印迹及免疫荧光的检测结果提示与对照组相比,ADAM10过表达组E-cadherin的mRNA及蛋白水平明显下降(P<0.05),α-SMA的mRNA及蛋白水平明显增加(P<0.05),结果提示过表达外源性ADAM10可引起HK-2细胞发生EMT表型转化。5、在过表达PAX2的NRK52E细胞中加入ADAM10的特异性抑制剂GI254023X,免疫印迹检测结果显示与对照DMSO组相比,GI254023X组E-cadherin蛋白表达有所增加,α-SMA蛋白表达部分下降(P<0.05),提示在大鼠肾小管上皮细胞中ADAM10部分上介导了PAX2诱导的EMT。6、免疫印迹和免疫组化检测结果显示梗阻3d E-cadherin蛋白表达较对照组即明显减少,而且随时间进展E-cadherin蛋白表达逐渐消失(P<0.05);梗阻3dα-SMA蛋白表达较对照组轻度增加,并且随时间进展α-SMA蛋白表达明显增多(P<0.05),表明UUO大鼠肾小管上皮细胞出现EMT表型改变。7、Real-time qPCR、免疫印迹和免疫组化检测结果显示在UUO大鼠中ADAM10 mRNA及蛋白表达水平均较sham组增加(P<0.05),并且以时间依赖的方式随梗阻时间延长逐渐增加;UUO组PAX2的mRNA较sham组增加(P<0.05),其蛋白水平也相应增多(P<0.05),并且也呈现时间依赖性。以上结果表明UUO大鼠梗阻侧肾脏ADAM10表达增加,并且其表达水平与UUO大鼠肾间质纤维化进展相一致,与PAX2的表达增加趋势也一致。8、5例慢性肾脏病(CKD)患儿中2例为Ⅱ期,3例为Ⅲ期,病理结果提示慢性间质性肾炎2例,局灶节段硬化性肾小球肾炎3例。免疫组化及免疫荧光检测结果均显示与对照轻度系膜增生患儿的结果相比,5例CKD患儿的肾活检标本中ADAM10均呈过表达。结论:1、在大鼠肾小管上皮细胞中PAX2在诱导细胞出现EMT表型改变的同时直接引起ADAM10的转录激活和表达增加。2、在人近曲小管上皮细胞中ADAM10可以诱导细胞出现EMT表型改变。3、在大鼠肾小管上皮细胞中ADAM10部分上介导了PAX2诱导的EMT。4、不仅在细胞水平同时在整体水平上证实了ADAM10参与肾间质纤维化的进展,为肾纤维化的治疗提供了新的靶点。