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目的：构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)或分泌型荧光素酶(Gaussia luciferase, Gluc)报告基因的单/双顺反子人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)微型基因组cDNA克隆并进行拯救,以探讨并验证RSV的辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用,同时,构建以巨细胞病毒(Cytomegalo virus, CMV)启动子为表达盒、密码子优化的辅助蛋白质粒系统,用于开展微型基因组拯救及RSV辅助蛋白功能的研究。方法：通过分子生物学技术,将人工合成的带EGFP基因的微型基因组cDNA克隆在改造的pBR322B载体上；将EGFP基因替换为Gluc报告基因,获得分别表达EGFP及Glue的单顺反子微型基因组,向上述质粒中插入一个编码无生物活性的蛋白的开放阅读框(open reading frame, ORF),获得分别表达EGFP或Gluc的双顺反子微型基因组。同时,构建基于CMV启动子表达盒及密码子优化的辅助蛋白质粒系统,Western blot鉴定辅助蛋白质粒的蛋白表达,并与之前构建的基于T7启动子表达盒的辅助蛋白质粒比较拯救微型基因组的效率。将以EGFP或Gluc为报告基因的单/双顺反子微型基因组分别与辅助蛋白质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达、Gluc检测试剂盒分析Gluc的表达,以及RT-qPCR对EGFP mRNA水平进行检测,以实现对微型基因组的拯救及验证RSV四种辅助蛋白在拯救过程中的作用。结果：构建了以EGFP或Gluc为报告基因的单/双顺反子微型基因组及其编码质粒,以及基于CMV启动子表达盒及密码子优化的辅助蛋白质粒系统。成功拯救了携带EGFP或Gluc报告基因的单/双顺反子微型基因组,并验证了四种辅助蛋白在拯救过程中的生物学意义,其中M2-1具有抑制转录终止和促进亚基因组转录的生物学活性。研究也表明以CMV启动子表达盒和密码子优化为基础的辅助蛋白质粒较以T7启动子表达盒的辅助蛋白质粒拯救效率有所提高。结论：成功构建了编码可表达EGFP或Gluc报告基因的单/双顺反子微型基因组的重组质粒,并验证了四种辅助蛋白、尤其是M2-1蛋白在双顺反子微型基因组的拯救过程中具有转录延长的生物学活性,同时,发现以CMV启动子表达盒和密码子优化为基础的辅助蛋白质粒能高效进行拯救,适用于后续的RSV重组病毒拯救实验研究。