第一部分泛素连接STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌预后的关系目的：研究泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT胞浆或胞核蛋白在不同宫颈组织中的表达情况及其与宫颈癌临床病理特征及预后的关系,分别探讨其在宫颈癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组织化学SP法在组织芯片中分别检测STUB1、hTERT蛋白在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia, CIN)及宫颈癌组织中的表达差异；采用卡方检验分析hTERT蛋白不同亚细胞表达情况与宫颈癌患者不同临床病理特征间的关系；采用Kaplan-Meier法分别分析STUB1、hTERT蛋白表达对宫颈癌患者总生存率的影响；采用COX回归法分析影响宫颈癌预后的独立因素；采用Spearman法分析宫颈癌组织中STUB1与hTERT表达的相关性。结果：宫颈癌组织中STUB1蛋白表达显著低于正常宫颈和CIN组织(P<0.05),而hTERT蛋白显著高表达(P<0.05)。在宫颈癌组织中,STUB1蛋白的低表达率在不同年龄、不同人流情况、不同绝经情况、不同肿瘤大小、不同组织类别、不同FIGO分期、不同淋巴结转移情况、不同阴道及宫旁浸润情况、不同放疗情况和不同局部复发情况的宫颈癌患者中无显著统计学差异(P>0.05)；而与肿瘤分化程度密切相关,即分化程度低的宫颈癌患者,STUB1蛋白的表达越低(P<0.05)。hTERT总蛋白的高表达率与肿瘤的FIGO分期、分化程度、局部复发密切相关,而与其它临床病理特征无相关性(P>0.05)：即FIGO分期高、分化程度低、局部复发的宫颈癌患者,hTERT总蛋白的表达越高(P<0.05)。STUB1蛋白或hTERT总蛋白高表达组和低表达组宫颈癌患者的5年生存率分别为(STUB1 51.8% vs 48.2%, P=0.016; hTERT 70.00% vs 63.50%, P=0.128);除此之外,hTERT蛋白胞核而不是其胞浆高表达组的宫颈癌患者5年生存率显著高于低表达(胞浆68.6% s 71.7%,P=-0.070；胞核61.8% vs 67.2%,P=0.016),但二者皆与宫颈癌其他临床病理因素均无相关性。多因素分析显示,hTERT蛋白总及胞核表达水平不是宫颈癌预后的独立影响因素；然而,STUB1及hTERT蛋白胞浆表达水平可作为宫颈癌预后的独立因素。Spearman相关分析显示,STUB1蛋白表达水平与hTERT胞浆或胞核蛋白表达情况皆无明显相关性。结论：STUB1及hTERT表达情况皆与宫颈癌发生过程密切相关。STUB1蛋白低表达水平与宫颈癌预后差密切相关；然而,hTERT总蛋白及胞核表达水平尚不能作为宫颈癌患者预后的预测指标,仅其蛋白胞浆表达水平有望成为宫颈癌患者预后判断的指标。因此,STUB1及hTERT蛋白胞浆表达情况有望成为预测宫颈癌预后的指标,并有可能成为宫颈癌治疗的新靶点。第二部分 泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT蛋白胞浆表达水平与宫颈癌放射敏感性的关系目的：研究泛素连接酶STUB1、端粒酶亚单位hTERT胞浆或胞核蛋白在宫颈癌放射敏感/抗拒株模型中的表达情况,分析其与宫颈癌细胞内在放射敏感性的关系。方法：采取6MV的X射线在室温下分别对指数生长期的C33A和Hela细胞按照每周一次600cGy的剂量进行辐射,分别照射10次和12次；采用克隆形成实验对照射后达到稳定传代的细胞株进行放射生物学参数测定,将照射后验证具有放射抗拒性的细胞株分别命名为C33AR和HelaR;采用Western blotting方法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中STUB1及hTERT蛋白表达水平；采用TRAP和Real-time PCR法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中端粒酶活性及端粒长度的变化；采用流式细胞仪分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中细胞周期及细胞凋亡的变化；采用transwell法分别检测C33A/C33AR和Hela/HelaR中细胞侵袭的变化；采用免疫荧光技术分别检测C33A/C33AR细胞照射前后Y H2AX的变化；采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测C33A/C33AR中hTERT总蛋白泛素化水平的变化。结果：克隆形成结果显示：C33A细胞株的D0=1.34±0.028,SF2=0.516±0.058;C33AR细胞株的D0=1.89±0.008, SF2=0.655±0.041;Hela细胞株的D0=2.59±0.007, SF2=0.625±0.041; HelaR细胞株的D0=2.76±0.012, SF2=0.751±0.041;表明经过6MV X线辐射后,C33AR及HelaR分别较C33A及Hela细胞的放射抗拒性显著增加(P<0.05)。Western blotting结果显示,两株放射抗拒株hTERT总蛋白表达水平较其亲本株显著升高(P<0.05),而STUB1蛋白表达水平较其亲本株显著降低。TRAP和Real-time PCR结果显示,放射抗拒株端粒酶活性和端粒长度分别较其亲本株显著提高(P<0.05)。细胞周期显示放射抗拒株中放射诱导的G2/M期阻滞持续时间显著较其亲本长(P<0.05)。细胞凋亡检测显示,放射抗拒株自发性与放射诱导的凋亡水平皆较其亲本株显著减少(P<0.05)。Transwell显示,C33AR的细胞侵袭力较其亲本株显著增加(P＞0.05)。免疫荧光结果表明C33AR中自发性和辐射诱导的γH2AX皆较其亲本显著减少(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示C33AR细胞中,hTERT总蛋白泛素化水平较其亲本降低；Western blotting检测C33A/C33AR中hTERT蛋白在胞浆或胞核的表达水平,结果显示放抗株中hTERT蛋白胞浆表达明显较高,hTERT蛋白胞核表达明显较低。结论：成功建立宫颈癌放射抗拒细胞株C33AR及HelaR,宫颈癌细胞内在放射敏感性降低可能与STUB1表达减少导致的hTERT蛋白胞浆降解减少,从而引起的端粒酶活性增加、端粒延长、射线诱导的G2/M期阻滞时间延长、自发性凋亡及射线诱导的凋亡率减少、自发性和辐射诱导的γH2AX减少有关。因此,深入研究STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制,明确hTERT蛋白胞浆降解增多对放射敏感性的效应,有助于为研究潜在放射增敏靶点提供新的方向。第三部分过表达泛素连接STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制目的：本课题组前期研究发现hTERT蛋白胞浆表达水平可能与宫颈癌放射敏感性相关,且泛素连接酶STUB1在放抗株中低表达,与hTERT总蛋白及胞浆表达水平负相关,可调控放射敏感性。然而,STUB1调控宫颈癌放射敏感性的机制尚不明。因此,本课题主要目的是研究STUB1作为人宫颈癌细胞放射增敏靶点的潜在机制。方法：采用Lipo2000脂质体转染联合嘌呤霉素筛选法构建STUB1过表达的稳定转染细胞株C33AR-STUB1、HelaR-STUB1及其对应的空白对照稳定细胞株C33AR-NC、HelaR-NC;采用Western blotting法验证并检测蛋白表达水平变化；采用克隆形成实验检测STUB1过表达后细胞放射敏感性的变化;采用TRAP和eal-time PCR法分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中端粒酶活性和端粒长度的变化；采用流式细胞仪法分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中照射前后细胞周期和凋亡的变化：采用免疫荧光分别检测C33AR-NC和C33AR-STUB1细胞照射前后DNA损伤灶点变化；采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测C33AR-NC和C33AR-STUB1中hTERT蛋白在胞浆中的泛素化修饰的变化。结果：成功构建过表达STUB1的C33AR-STUB1和HelaR-STUB1细胞株及其空白对照C33AR-NC和HelaR-NC.克隆形成结果显：C33AR-NC细胞株的D0=2.44, SF2=0.603;C33AR-STUB1细胞株的D0=1.70, SF2=0.441; HelaR-NC细胞株的D0=2.44, SF2=0.751; HelaR-STUB1细胞株的D0=2.33,SF2=0.533;表明过表达STUB1的细胞C33AR-STUB1和HelaR-STUB1获得了显著的放射增敏效应。TRAP和Real-time PCR结果显示,C33AR-STUB1细胞端粒酶活性和端粒长度皆较C33AR-NC细胞显著降低(P<0.05)；Western blotting结果显示,过表达STUB1后,细胞中hTERT蛋白总及胞浆表达水平降低,但对胞核表达无影响,PI3K、AKT及p-AKT表达降低,端粒结合蛋白TRF1及RAP1表达增加,TRF2、PTOP1、POT1及TIN2表达减少；Co-IP结果显示hTERT蛋白胞浆的泛素化修饰增加。细胞周期检测显示STUB1过表达后,细胞G2/M期分布增加；联合射线后细胞周期结果显示STUB1过表达显著缩短射线诱导的G2/M期阻滞持续时间；Western blotting结果显示过表达STUB1,显著降低ATM、 ATR、Chk1、Chk2、p-Chk1及p-Chk2表达水平,而p-ATM、p-ATR及CDC25C表达水平增加。细胞凋亡检测结果显示STUB1过表达后,细胞自发性和射线诱导的早期凋亡皆增加；Western blotting结果显示过表达STUB1,促凋亡蛋白Bax与抑制凋亡蛋白Bcl-2表达的比例提高。免疫荧光检测提示STUB1过表达,显著增加自发性及射线诱导的DNA损伤灶。结论：过表达泛素连接酶STUB1可导致放射增敏,其调控细胞放射敏感性的可能机制如下：通过促进hTERT蛋白胞浆泛素化修饰使hTERT蛋白胞浆储备减少,并通过下调P13K及AKT,使PI3K/AKT介导的hTERT磷酸化激活减少,从而导致进入胞核的有活性的hTERT减少,从而降低端粒酶活性,进而端粒缩短,下调大部分端粒相关蛋白,使端粒相对欠稳定,从而使ATM/ATR-Chkl/Chk2-CDC25C介导的细胞周期G2/M期阻滞缩短、Bax/Bcl2比例提高而致细胞凋亡增加,进而增加细胞DNA损伤灶,最终导致放射增敏。因此,STUB1有望成为放射增敏的靶点,其通过影响hTERT蛋白胞浆表达水平从而调控放射敏感性的现象,为研究端粒稳态相关因素调控放射敏感性的机制提供了可供参考的思路。