副干酪乳杆菌芳香族氨基酸转氨酶克隆表达及其酶学性质研究

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苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是一种天然生物防腐剂,能抑制多种引起食品腐败的真菌和细菌。乳酸菌中的芳香族氨基酸转氨酶能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸进而还原为苯乳酸,是产苯乳酸的限速酶。根据NCBI数据库中Lactobacillus casei str. Zhang全基因组序列中的芳香族氨基酸转氨酶基因设计引物,以副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei W2)基因组DNA为模板,PCR扩增基因并连接到pMD19-T载体。测序结果表明:L. paracasei W2芳香族氨基酸转氨酶基因长1164bp,与L. casei str. Zhang的基因序列相似性为100%。分析和预测副干酪乳杆菌(L. paracasei W2)芳香族氨基酸转氨酶基因及其编码蛋白的结构和特性,以指导其生物学功能的实验研究。对编码蛋白进行疏水性分析、磷酸化位点预测、二级、三级结构预测并构建分子进化树。结果表明该基因编码387个氨基酸,理论相对分子质量是41961.2Da,等电点为6.03,具有完整的保守结构域和保守功能位点,该蛋白有两个跨膜螺旋区。与干酪乳杆菌的进化关系最近。将芳香族氨基酸转氨酶基因连入表达载体,成功构建重组表达质粒,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE分析显示出42kD的特征性蛋白条带,与预期大小一致。对重组芳香族氨基酸转氨酶进行酶学性质研究,其酶活测定的最适pH为6.8、最适温度为50℃。芳香族氨基酸转氨酶活性在低于50℃时、接近中性条件下,其稳定性较好。Fe3+、Cu2+能显著抑制转氨酶活性,而Mn2+、Ca2+、Mg2+终浓度约10mM、Zn2+终浓度约5mM时,对转氨酶有促进作用。重组芳香族转氨酶对谷氨酸的Km为0.0734mol/L,Vmax=1.976μmol/min,对天冬氨酸的Km为0.2038mol/L,Vmax=1.145μmol/min。
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