自1898年肾素（renin）被发现以来，关于肾素—血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的研究已经进行了一百多年，并且不断有新的RAS成员和机制被发现。实验证实，RAS在心血管疾病，神经系统疾病，肾脏疾病中发挥着十分重要的作用，其中包括糖尿病肾病。长期以来一直认为，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）为RAS的主要的生物活性肽，可通过血管紧张素受体引起效应器细胞的相应活动，在AngⅡ上游的各种成分是没有受体的。最近二十年来，RAS研究的热点集中在AngⅡ及其受体（AT₁R和AT₂R）和相应的信号转导途径。运用免疫组化及分子生物学技术发现除循环中存在RAS外，RAS的所有成分广泛存在于心、肾、脑、血管、肾上腺及睾丸、肺等局部组织中，称为局部RAS。局部RAS的发现，使传统的经典观点发生了根本性的变化。由于RAS瀑布下游各成分的作用和调控越来越复杂，而处于RAS瀑布上游的肾素则是该系统的第一个限速酶，所以肾素可能是一个更好的研究治疗一些疾病的靶点。随着研究的深入进行，发现在器官局部（特别是在间质液中）肾素的浓度是循环中的100倍，因此推测可能存在某些可以与肾素结合的蛋白或受体，从而使局部肾素水平提高，并引起一定的生物学效应。近年来的研究证实，肾素不仅有酶的作用，而且还有结合蛋白或受体。其中有两种蛋白已被认定：一种是6-磷酸甘露糖（mannose-6-phosphate receptor，M6P）受体，另一种是肾素（原）受体（renin／prorenin receptor，RnR）。M6P受体与肾素（原）结合后只引起肾素的内吞，并不直接引起细胞内或细胞外效应。2002年Nguyen等首次报道了人肾素／肾素原受体（RnR）的存在，并且克隆了该受体。RnR的mRNA广泛分布在心、脑、肝、肾、胰及胚胎；肾素（原）与RnR结合后，使血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）向血管紧张素Ⅰ（ANGⅠ）转化的效率提高4倍，并激活MAPK信号转导通路（ERK1／2）。Nguyen等通过免疫荧光的方法确定，RnR主要存在于心脏的血管平滑肌细胞和肾脏的系膜区。另外发现在巨噬细胞、T细胞和粒细胞中也存在RnR的mRNA和蛋白表达。一般认为，RnR是一个包含350个氨基酸的单跨膜结构的酪氨酸激酶受体，克隆的RnR位于细胞表面，但是也有一些报道RnR存在于细胞内。自从RnR被发现以来，关于RnR在肾脏和心脏中的生理及病理的作用越来越受到重视，特别是在糖尿病肾病和心肌梗死发病中的研究。Ichihara等报道，肾素原可能通过RnR参与糖尿病肾病的发病，而且肾素原的柄区肽（handle region peptide，HRP）可以竞争性结合RnR，从而抑制糖尿病肾病和心脏纤维化的发展；最近Huang等报道，在大鼠系膜细胞中，肾素与RnR结合后可增加细胞转化生长因子β1（TGF-β1）、纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和PAI-1；Schefe等报道，早幼粒细胞锌指蛋白（promyelocytic zinc finger protein，PLZF）是RnR的上游调控因子，肾素通过RnR促进大鼠H9c2心肌细胞的增殖并减少细胞的凋亡。这些研究表明：RnR在各种生理及病理生理机制，特别是心血管疾病和糖尿病肾病的发病中发挥着十分重要的作用。糖尿病肾病是糖尿病患者最常见的并发症之一，是糖尿病病人发病和过早死亡的主要原因之一。最近二十年来，在治疗糖尿病肾脏纤维化方面的最重大突破就是RAS两种抑制剂(血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI，如captopril）和血管紧张素受体抑制剂（ARBs，如losartan）可以改善终末期糖尿病肾病患者的肾脏功能，并已经投入临床使用。但是近几年动物实验和临床试验表明：即使这两种药物使用的浓度很高，也只能部分缓解终末期肾脏功能衰竭的进程，而不能完全阻断肾脏形态和功能改变。这两种药物的局限性部分是因为它们引起的肾素升高以及肾素的不依赖于AngⅡ的促纤维化作用，也就是说，肾素可通过RnR直接促进肾脏纤维化。因此，研究RnR在肾脏中的生物学功能可以更好地揭示糖尿病肾病的发病机制，并为临床治疗提供新的证据。肾素抑制剂（如aliskiren）可通过抑制血浆肾素活性发挥临床治疗作用，并且已经进入第三期临床实验。虽然肾素活性被抑制，但是由于使肾素（原）蛋白明显增加，而增加的肾素（原）蛋白可能通过与RnR结合而产生细胞生物学效应，因此对RnR研究也有助于对肾素抑制剂安全性和有效性的评估。本文的目的是探讨大鼠肾脏系膜细胞是否表达RnR，如果表达RnR，则RnR的生物学功能有哪些，RnR的表达受哪些因素调控；并且探讨糖尿病肾病时肾脏内RnR的表达是否发生改变，如果发生改变，则这种改变在糖尿病肾病的发生中是否起作用。我们的实验主要分以下三部分：第一部分：观察在体外培养的大鼠肾小球系膜细胞和正常Sprague-Dawley（SD）大鼠肾脏中是否表达RnR，以及RnR在大鼠肾小球系膜细胞中的功能。首先，建立大鼠肾小球系膜细胞（MCs）株的培养方法，鉴定细胞株的特性，为进一步进行系膜细胞各种生物学特性及糖尿病肾病研究奠定基础。大鼠肾小球系膜细胞株由复旦大学上海医学院病理系郭慕依教授增予。用倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征；用免疫细胞化学方法显示肾小球系膜细胞特异性表面标志。用RT-PCR，Western blotting确定系膜细胞和肾脏RnR mRNA和蛋白的存在；利用免疫荧光技术确定RnR表达的部位。实验结果显示：用光学显微镜观察，体外培养的大鼠肾小球系膜细胞呈梭形、不规则星形或三角形。胞浆内结蛋白和肌动蛋白均为阳性，而第Ⅷ因子则为阴性。体外培养的大鼠肾小球系膜细胞和SD大鼠肾脏中均有RnR mRNA和蛋白表达；在系膜细胞中，RnR主要存在于核周区域和细胞膜上；在大鼠肾脏中，RnR主要存在于肾脏皮质肾小球系膜区。以上结果表明，培养的大鼠肾小球系膜细胞具有其特征性形态和免疫组化的特异性表面标志，可以用于进一步的研究。在整体动物实验中证实，RnR存在于肾小球系膜区，与体外培养的肾小球系膜细胞存在RnR一致。为进一步阐明生理及病理状态下RnR在系膜细胞中的功能，我们用RnR的多肽抑制剂—肾素原柄区肽（HRP）和RNA干扰（RNAi）技术对正常状态下的系膜细胞以及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和高葡萄糖（30mM）刺激的系膜细胞的功能进行了观察。结果如下：一、通过RT-PCR和放射免疫方法确定，在系膜细胞内和细胞培养液中有肾素mRNA和肾素活性的存在。用合成的HRP以及FITC标记的HRP（FITC-HRP）观察HRP进入细胞内并与RnR结合的情况，证实HRP可以进入系膜细胞，并与RnR结合。二、在正常状态下的系膜细胞中，用Western blotting方法观察到，给予HRP(10^-6M)后，细胞内ERK1／2的磷酸化水平迅速降低；给予不同浓度的HRP24小时、48小时和72小时，用real-time RT-PCR观察到系膜细胞转化生长因子β1（TGF-β1）mRNA表达显著降低；用5—溴-2’脱氧尿嘧啶（BrdU）细胞增殖酶联免疫吸附剂盒（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）观察到，HRP(10^-6M和10^-7M)可抑制系膜细胞增殖；用明胶酶谱法观察到，HRP(10^-8M，10^-7M和10^-6M)可以增加基质金属蛋白酶-2（MMP-2）活性，并且呈剂量依赖性。三、在正常状态下的系膜细胞中，针对RnR进行RNAi，观察siRNA对系膜细胞的增殖和分泌的影响。设计并体外合成针对大鼠RnR基因（GenBankAccession AB188298）的siRNA序列，应用real-time RT-PCR及Westernblotting方法检测RnR基因和蛋白的表达情况，确定siRNA干扰效率大于75％后，观察到在转染siRNA72小时后TGF-β1 mRNA表达降低，系膜细胞增殖受到抑制；MMP-2蛋白总量和MMP-2活性均增加；细胞培养液中Ⅳ型胶原的分泌量明显减少。以上结果与HRP阻断剂的作用一致，说明干扰RnR表达后，可以抑制系膜细胞增殖和细胞外基质（ECM）的分泌。以上的结果支持这样的假设：在系膜细胞中，RnR具有促细胞增殖和促ECM分泌的作用。四、观察HRP对AngⅡ的细胞效应的影响。在实验中我们观察到：AngⅡ可促使系膜细胞增殖，TGF-β1 mRNA表达增加，MMP-2活性降低。如同时给予HRP，可以对抗以上这些由AngⅡ刺激引起的细胞效应。以上结果说明：抑制RnR可以对抗AngⅡ引起的促细胞增殖和降低基质降解的效应。因此可推测，AngⅡ对系膜细胞的促增殖和促分泌作用可能是通过RnR介导的。五、观察HRP对高葡萄糖的细胞效应的影响。在实验中我们观察到：高葡萄糖（30mM）可促使系膜细胞TGF-β1 mRNA表达增加，MMP-2活性降低。HRP可以对抗以上这些高葡萄糖引起的细胞效应。以上结果表明，RnR介导了高葡萄糖对系膜细胞的促生长和促分泌作用。第二部分：AngⅡ和高葡萄糖对系膜细胞RnR表达的调控。一、AngⅡ对系膜细胞RnR表达的影响。不同浓度的AngⅡ(10^-8M，10^-7M和10^-6M)可使系膜细胞RnR mRNA和蛋白表达减少，此作用被AngⅡ的2型受体（AT₂R）拮抗剂（PD123319）阻断，但不能被AngⅡ的1型受体（AT₁R）拮抗剂（losartan）阻断。AT2R的激动剂（CGP42112A）也可使系膜细胞表达RnR减少。另外，AngⅡ可以降低系膜细胞肾素mRNA表达水平，给予PD123319可以阻断AngⅡ的这种作用，而且CGP42112A(10^-8M和10^-7M)也可以降低肾素mRNA表达水平。这些结果表明，AngⅡ可能通过AT₂R（而不是AT₁R）使RnR表达减少。二、高葡萄糖对系膜细胞RnR表达的影响。高葡萄糖（30mM）使系膜细胞RnRmRNA和蛋白的表达减少，此作用被AT₂R拮抗剂（PD123319）阻断，但不能被AT₁R)拮抗剂（losartan）阻断。另外，高葡萄糖使系膜细胞AT₂RmRNA表达水平增高，而AT₁R mRNA表达水平没有明显变化。这些结果表明，高葡萄糖可以通过某些途径使RnR表达减少；同时高葡萄糖使AT₂R表达增加，这至少可能是高葡萄糖使RnR表达减少的机制之一。第三部分：研究RnR在正常SD大鼠和链尿佐菌素（STZ）诱发的糖尿病大鼠肾脏中的表达，以及STZ糖尿病大鼠经losartan治疗的肾脏中RnR表达的变化。一、观察在STZ诱发的糖尿病大鼠肾脏中RnR mRNA表达的变化。首先建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型，将80只SD雄性大鼠分为正常对照组（C组，n=40）和糖尿病组（DM组，n=40）。每个时间点每组各8只大鼠。实验结果：给予一次腹腔注射STZ诱发糖尿病，DM组血糖高于16.7mM，体重明显减轻，尿量增加，尿蛋白排出量增多，从6W开始形态学观察DM组大鼠肾脏出现不同程度的肾小球基底膜增厚、肾小球系膜区增宽、系膜细胞增生、基质增多等损害。在五个不同时间点（1，3，6，12，24周）时，DM组肾脏中RnR mRNA水平均比C组低（P＜0.05）。RAS其他成分变化如下：DM组大鼠血浆肾素活性较C组明显降低（P＜0.05）；DM组大鼠血浆AngⅡ较C组明显升高（P＜0.05）：DM组大鼠肾脏组织AngⅡ较C组明显升高（P＜0.05）。以上结果表明，糖尿病大鼠肾脏中RnR的表达明显降低。二、观察losartan治疗后的STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏中RnR mRNA表达变化。将24只雄性SD大鼠分为三组，每组8只：正常对照组、糖尿病未治疗组、糖尿病losartan治疗组。其中losartan治疗组是在给予STZ处理后一周，血糖高于16.7mM的大鼠给予losartan 20mg／kg／d灌胃，持续6周，正常对照组（C组）和糖尿病未治疗组（DM组）给予等量双蒸水灌胃。于STZ处理后1、3、5、7周（即losartan治疗0，2，4，6周）测定各组大鼠血糖、体重、血压、尿量、尿蛋白排出量、血浆肌酐，于治疗第6周处死大鼠取肾脏组织。结果：losartan治疗2周后，losartan治疗组的尿蛋白排出量和血肌酐较糖尿病未治疗组减少（P＜0.05）。RAS成分变化：DM组肾脏中RnR mRNA水平均比C组低（P＜0.05），losartan治疗组RnR mRNA水平均比C组和DM组低（P＜0.05）。此外，DM组。肾脏中AT₂R mRNA水平比C组低（P＜0.05），而losartan治疗组肾脏AT₂R mRNA水平较C组和DM组均增加。由以上结果表明，在给予losartan（20mg／kg／d）后，AT₁R被阻断，而AT₂R上调，从而使RnR表达进一步降低，这可能是losartan对糖尿病肾病产生治疗效果的机制之一。综上所述，本研究结果提示：在体外培养的肾小球系膜细胞中存在RnR，RnR对系膜细胞具有促细胞增殖和促纤维化的作用；AngⅡ和高葡萄糖可通过AT₂R调控RnR表达，使RnR的表达降低；在正常大鼠中，肾脏存在RnR；在STZ诱导的糖尿病大鼠，肾脏中RnR的表达降低；糖尿病大鼠经losartan治疗后，肾脏中的AT₂R表达增加，从而使RnR进一步降低，因而可以减轻肾脏损害。