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分生孢子是常规杀虫真菌生物农药的活性成分，但孢子制剂大都存在保质期短、抗逆力差、防效不稳的不足；加之一些真菌难于产孢或产孢率极低，限制了杀虫真菌生物农药的广泛应用。莱氏野村菌（Nomuraea rileyi=Syn.Metarhizium rileyi）在自然条件下能侵染多种鳞翅目夜蛾科害虫，是一种环境友好型的生防真菌，但因其发酵生产营养要求特殊、产孢条件苛刻，生产周期长，生产成本高，限制了其商业化生产和应用。针对野村菌的生物学特性，重庆大学生命科学学院微生物团队利用液体发酵诱导形成微菌核（已获专利授权），因其具有抗逆性强、稳定性好、耐储存、可持续侵染等优点可以代替分生孢子用于害虫生物防治，并对微菌核发育及调控机理开展了一系列初步的研究。 2013年重庆大学生命科学学院微生物团队通过转录组学研究莱氏野村菌微菌核形成相关基因和调控机理，发现微菌核形成过程中其微环境中的pH发生规律性的变化，且在莱氏野村菌两型转换的转录组库中发现与pH调节相关的基因NrPacC和NrPalI显著上调表达，但迄今为止在野村菌中尚无两个基因功能的相关研究报道。本课题旨在以莱氏野村菌为研究对象，根据已有的转录组信息，克隆得到NrPacC和NrPalI基因，对其进行生物信息学分析，进一步构建其敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化体系，对NrPacC和NrPalI基因的功能进行研究，以期为莱氏野村菌微菌核的液体发酵的分子调控机理研究奠定基础，并为产率提升提供理论指导。获得如下主要研究结果： ①莱氏野村菌NrPalI和NrPacC基因克隆与序列分析 根据莱氏野村菌两型转化转录组库中对基因的功能注释，调取目标基因的Unigene序列，从莱氏野村菌CQNr01菌株中扩增得到靶标基因，分别命名为NrPacC和NrPalI，其登录号分别为OAA38885.1和OAA42720.1。序列分析显示：NrPacC基因开放阅读框为2028bp，编码592个氨基酸，含有2个内含子，长度分别为168bp和81bp，两内含子相间283bp；NrPalI基因开放阅读框为2103bp，编码576个氨基酸，含有1个内含子，长度为62bp。生物信息学分析表明：NrPacC基因编码64.433KDa的蛋白，其等电点为8.66，无跨膜结构域，含有3个Cys2His2锌指结构，能特异性结合靶标基因启动子区域的5‘-GCCARG序列；NrPalI基因编码61.398KDa的蛋白，其等电点为9.23，具有三个跨膜结构域，具有SUR7家族的保守结构域。 同源序列比对和进化分析表明，NrPacC和NrPalI基因编码的蛋白与17种真菌对应同源蛋白同源性在23.4％～91%，NrPacC和NrPalI蛋白分析显示其与罗伯茨绿僵菌和贵州绿僵菌具有最近的亲缘关系。 ②NrPacC和NrPalI基因敲除载体构建和突变菌株筛选 通过染色体步移技术FPNI-PCR扩增得到NrPacC和NrPalI基因的上下游序列，在此基础上构建敲除载体（Pzp-Ptrpc-Hph-NrPacC和Pzp-Ptrpc-Hph-NrPalI），利用农杆菌介导的莱氏野村菌遗传转化体系（同源双交换）对基因进行敲除，通过传代培养和抗性筛选获得两基因的单敲除突变菌株：△NrPacC和△NrPalI。 ③NrPacC和NrPalI基因突变菌株表型分析 在SMAY培养基上，NrPacC和NrPalI的敲除突变菌株明显延迟了莱氏野村菌由酵母态向菌丝态的转换；菌丝发育异常，分生孢子的产量降低但分生孢子形态没有影响。碱性条件下，NrPacC敲除菌株生长受到明显的抑制，产孢量显著性下降而NrPalI突变菌株较野生型无明显差异。抗逆性分析发现，NrPalI基因缺失菌株对氧胁迫、金属离子胁迫都不敏感；在细胞壁破坏剂条件下，初期菌落生长受到抑制，后期与野生型无明显差异；渗透压胁迫、盐胁迫条件下产孢量较野生型菌株下降。在不同的胁迫条件下，NrPacC突变菌株的产孢量较野生型显著性下降，在过氧化氢和荧光白胁迫下延长其两型转换时间，在氯化钠和氯化锂胁迫下，NrPacC突变菌株生长明显受到抑制，且产孢量显著下降。微菌核形成中，NrPacC和NrPalI基因缺失菌株在早期有大量的菌丝生成且加深了微菌核的色素沉淀;NrPalI突变菌株菌丝较早缠绕开始形成微菌核，其微菌核产量显著性上升，NrPacC基因敲除菌株微菌核相对野生型较大，但总生物量和微菌核产量（单位体积培养液中微菌核数量）与野生型相比无明显差别。 ④NrPacC和NrPalI基因表达模式分析 通过实时荧光定量PCR对NrPacC和NrPalI基因在不同pH条件和微菌核形成过程中表达量进行分析。 NrPacC和NrPalI基因随培养基中pH升高，表达量呈上升趋势，碱性条件下显著上调表达，较酸性条件下表达量分别升高8倍和6.5倍。两基因在碱性条件下高表达，表明NrPacC和NrPalI基因参与应对外界碱性环境的调节。 NrPacC和NrPalI基因在微菌核形成的各个时期均有不同程度表达，前期表达量较低，4d时急剧升高，较2.5d表达量升高12倍，之后呈现下降趋势且两基因的表达趋势呈现一致性。即两基因在微菌核形成期高量表达，说明NrPacC和NrPalI基因参与微菌核形成的调控。 ⑤△NrPacC和△NrPalI突变菌株毒力分析 通过体表注射和体表点滴侵染实验对突变菌株毒力进行测试，结果表明：NrPacC缺失菌株的半致死时间（LT50）分别为9±0.6d、9.5±0.8d，整体较野生型延迟2d左右，而NrPalI突变菌株与野生型无明显差异。观察分生孢子侵染斜纹夜蛾形成僵虫的发现：野生型菌株体表侵染和体内注射感染的斜纹夜蛾幼虫在保湿培养7d时僵虫表面均有菌丝生成，而两个突变体对应的僵虫表面此时并无菌丝；10d时，野生型菌株和NrPalI突变菌株侵染的僵虫已经产生分生孢子，但NrPacC突变菌株侵染致死的僵虫只有部分菌丝穿透表皮长出，无分生孢子产生。 以上结果表明，NrPacC基因缺失导致菌株毒力下降而NrPalI敲除菌株对斜纹夜蛾幼虫的致死率无明显影响。