糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的主要并发症之一。在发达国家，DR是引起失明的四大主要眼病之一。在我国，由中华医学会糖尿病学分组织调查报告中表明，糖尿病眼并发症占34.3％，估算我国糖尿病病人中双目失明者高达45万人<(1)>。 糖尿病视网膜病变的基本病理过程是：糖尿病时，视网膜暴露于高浓度的血浆葡萄糖中，致使视网膜毛细血管壁内长期处于高渗状态，造成内皮细胞基底膜增厚、周细胞丧失和内皮细胞受损，血一视网膜屏障功能丧失，视网膜渗出和出血性改变产生；进一步毛细血管闭塞，微动脉瘤形成和引起大片视网膜缺血，从而刺激视网膜新生血管产生。新生血管的发生机制以及如何控制新生血管的形成，已成为目前糖尿病视网膜病变治疗中最为棘手的问题，也是影响预后的关键。 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)在糖尿病视网膜病变的发生发展过程中起到了极其重要的作用，但外源性的VEGF很难产生视网膜新牛血管。目前采用动物模型进行VEGF实验研究主要有三种方法：1.外源性VEGF注射<(2)>。但外源性注射不可避免地会产生外伤和炎症，使得色素源性生长因子、成纤维细胞生长因子等多种生长因子同时参与作用；2.VEGF缓释装置的应用<(3)>。将VEGF做成持续性释放的小丸放入大鼠的玻璃体腔或视网膜下，3.VEGF的视网膜内源性表达<(4)>。即建立视网膜特异性表达的VEGF转基因鼠模型。该转基因鼠具有如下优点：VEGF诱导的视网膜新生血管仅局限于视网膜而不出现在脉络膜；产生的视网膜新生血管持续时间长达4个月以上，从而易于进行相关的药物研究。该动物模型给视网膜新生血管的防治研究开辟了一个新领域。 本文进行了以下方面的研究： 1．研究目的 从HL60细胞(人粒细胞白血病细胞系)中，根据人VEGFcDNA序列，设计一对引物，通过总RNA提取、逆转录，及PCR扩增，获得人血管内皮生长因子(hVEGF<,165>)eDNA。 将酶切纯化的质粒pcDNA<,3>与经同样酶切纯化处理的hVEGF<,165>PCR产物在T<,4>DNA连接酶作用下进行连接，构建pCD-hVEGF<,165>真核表达载体。 将pCD-hVEGF<,165>真核表达载体在大肠杆菌中表达出人VEGF<,165>并进行鉴定。 2．研究内容及方法 (一)PCR引物的设计与合成 根据文献报告的人VEGFcDNA序列，设计一对引物，其中P<,1>为上游引物，P2为下游引物。在引物P<,1>、P<,2>两端通过改变碱基引入了BamH I和EcoR I两个限制性内切酶酶切位点。引物经计算机分析软件Primer分析。 P<,1>:5’-CGGGATCCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3BamHIP<,2>:5’-TCGAATTCTCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3EcoRI(二)总RNA提取及逆转录及PCR扩增hVEGF eDNA 提取HL60细胞总RNA，以Oligo(dT)<,12-18>为引物，利用Superscript Preamplifieation System(GIBCO)反转录合成eDNA第一链。以反转录产物2ul为模板，以P<,1>、P<,2>lul为引物进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。 (三)pCD-hVEGF<,165>重组表达质粒的构建及鉴定 将PCR产物采用割胶法进行纯化回收。将纯化后的PCR产物进行双酶切。挑取单个含质粒pcDNA<,3>的细菌克隆菌接种入LB培养基中，提取质粒DNA。将酶切纯化的质粒pcDNA<,3>与经同样酶切纯化处理的hVEGF<,165>PCR产物在T<,4>DNA连接酶作用下进行连接，建立pCD-hVEGF<,165>重组表达质粒。对重组质粒采用碱裂解法提取质粒DNA、EcoRI+BamHI双酶切、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。对双酶切鉴定正确的重组质粒，再用PCR进行鉴定。 (四)hVEGF<,165>基因在大肠杆菌中的表达 将含酶切鉴定正确的重组质粒pCD-hVEGF<,165>的大肠杆菌BL21(DE3)用1mmol／L IPTG进行诱导表达，行10％SDS-PAGE电泳分析。 3．研究结果 (一)hVEGF<,165>基因的PCR扩增 利用设计的引物，从HL60细胞中提取VEGF总RNA，经PCR扩增出VEGF基因片段，加上引入的限制性内切酶位点识别序列、终止密码子及保护序列，PCR产物大小为600bp左右。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，示扩增出特异的目的基因片段，扩增产物与预期大小一致，空白对照未扩出任何条带。(二)pCD.hVEGF165重组表达质粒的构建与酶切鉴定将上述PCR产物纯化后，用EcoR I+BamH I进行双酶切后与经相同酶切的质粒pcDNA<,3>转化大肠杆菌，在LB-氨苄青霉素平板上进行初步筛选。随机挑取数个克隆菌接种扩增后，提取重组质粒用EcoRI+BamHI进行双酶切鉴定。2％琼脂糖凝胶电泳检测，示pCD-hVEGF<,165>切出与hVEGF<,165>的PCR产物大小基本一致的条带。 (三)pCD-hVEGF<,165>的序列测定 将含酶切鉴定正确的重组质粒pCD-hVEGF<,165>大肠杆菌，于LB培养液中37℃、250r/min培养45h，从培养基的上清液中提取成熟的单链重组DNA作为测序模板，于373A型DNA自动序列分析仪上做序列分析。结果表明重组质粒pCD-hVEGF<,165>中含有hVEGF<,165>cDNA片段。 (四)pCD-hVEGF<,165>在大肠杆菌中的表达 经IPTG诱导后，含pCD-hVEGF<,165>的大肠杆菌在约22kDa处出现一条特异的表达蛋白条带，而未经诱导的在相应位置上未见明显的表达条带。表达蛋白的分子量大小与二聚体的理论预测值基本一致。4.研究结论(一)成功地获得了人血管内皮生长因子(hVEGF<,165>)cDNA。 (二)成功地构建了pCD-hVEGF<，165>真核表达载体。 (三)成功地将pCD-hVEGF<，165>真核表达载体在大肠杆菌中表达。 (四)为进一步建立VEGF转基因动物模型，研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础。