第一部分缺氧对肝癌细胞转移能力及上皮间质转化影响的实验研究目的：目前肝动脉化疗栓塞(TACE)已经成为不能手术切除肝癌的标准治疗,但是TACE后残存癌细胞处于缺氧环境中,其分子生物学特性会发生改变。本研究利用大鼠肝癌细胞株McA-RH7777,通过氯化钻(CoCl2)诱导缺氧,研究体外缺氧对肝癌细胞迁移及侵袭能力影响,并探索其相关分子机制。方法：利用本实验室前期建立的稳定表达绿色荧光蛋白的McA-RH7777细胞株,分别以不同浓度的CoCl2诱导缺氧后进行培养,通过CCK-8法确定有效的药物浓度。采用Transwell实验研究缺氧对肝癌细胞侵袭能力的影响,并通过划痕实验研究缺氧条件下细胞迁移能力的变化。通过Western blot分析细胞缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)和上皮间质转化(EMT)相关分子标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的变化,实时定量PCR进一步检测EMT调控转录因子Twist和SnailmRNA水平差异。结果：100 μmol/L CoCl2处理24h能诱导缺氧条件,HIF-1α表达水平升高,但是McA-RH7777细胞增殖和凋亡无显著影响。Transwell实验结果显示缺氧组通过Matrigal膜的细胞数为30.2±2.46,较对照组(20.4±1.89)明显增加,差异有统计学意义(P=0.013)。划痕实验显示缺氧条件下细胞划痕修复能力较对照组明显增加。缺氧细胞上皮分子E-cadherin表达减少,而N-cadherin、Vimentin等间质分子表达增多,提示缺氧条件下肝癌细胞EMT的发生。缺氧后肝癌细胞Twist mRNA水平增加,与对照组比较,mRNA水平差异有统计学意义。而Snail mRNA水平与对照组相比,差异无统计学意义。结论：体外缺氧能引起Twist转录因子水平增加,诱导肝癌细胞发生EMT,从而促进细胞运动及侵袭能力的增加。第二部分三氧化二砷抑制缺氧诱导的肝癌细胞上皮间质转化及其机制的实验研究目的：三氧化二砷(ATO)对包括急性早幼粒细胞白血病在内的多种肿瘤均具有一定的杀伤作用,最近发现在肝癌的治疗中亦有一定疗效。本部分实验研究体外缺氧和常规培养条件下ATO对大鼠肝癌McA-RH7777细胞侵袭、转移能力的影响以及机制。方法：利用本实验室建立的稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌细胞株,研究ATO对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。以氯化钴(COCl2)诱导体外缺氧条件,通过划痕实验和Transwell实验分别研究ATO在体外缺氧条件下对肿瘤细胞的侵袭能力的影响。免疫荧光及Western blot进一步分析ATO处理后细胞上皮间质转化(EMT)相关分子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达水平的变化,研究ATO对缺氧诱导的EMT及其调节因子Twist的影响。结果：ATO对McA-RH7777大鼠肝癌细胞增殖有抑制作用,能引起不同程度的细胞凋亡,呈明显的时间和剂量依赖关系。低浓度ATO (2 μmol /L)作用24h对细胞增殖和凋亡影响作用不显著,但是能明显抑制细胞的迁移和侵袭能力。对于缺氧引起的肝癌细胞迁移和侵袭能力增加,ATO有明显的抑制作用。免疫荧光及Western blot结果显示,与对照组细胞相比,缺氧细胞的胞膜E-cadherin表达减少,N-cadherin表达增加。ATO处理后能上调缺氧细胞E-cadherin的表达,抑制缺氧细胞发生EMT。同样对于缺氧后细胞胞膜及核内Twist表达的增加,ATO有明显的抑制作用。结论：ATO能诱导McA-RH7777大鼠肝癌细胞凋亡,抑制细胞的增殖,呈明显的时间和剂量依赖效应。低浓度ATO能下调Twist表达抑制缺氧诱导的EMT,从而抑制缺氧条件下肝癌细胞侵袭转移能力的增加。第三部分介入栓塞联合三氧化二砷对大鼠肝癌转移的影响及其机制的实验研究目的：本实验通过肝癌动物模型研究经导管动脉栓塞(TAE)对肝细胞肝癌(HCC)转移潜能潜能的影响,并进一步研究TAE术后联合应用ATO对HCC侵袭和转移的影响。方法：将McA-RH7777大鼠肝癌细胞种植于Buffalo大鼠皮下成瘤,然后应用皮下瘤组织块建立大鼠原位肝肿瘤模型40只。将大鼠随机分为4组：TAE+ATO组、TAE组、ATO组和对照组。TAE术在建模后14天进行,采用逆行胃十二指肠插管,注入超液化碘油(0.2 ml/kg)与生理盐水的混悬液(碘油：生理盐水=1：2)。ATO在TAE术后3天开始按2 mg/kg腹腔内注射,每天一次,每次按2 mg/kg体重给药,连续应用5天后改为每周3次,术后2周停止给药。以生理盐水作为栓塞剂和药物的阴性对照。干预治疗前后定期行MRI检查,评价肝内肿瘤的生长情况。TAE术后14天取各组5只大鼠行病理组织学检查。通过荧光显像观察肺部转移情况,残癌细胞分子水平的变化则通过Western blot和免疫组化评估。各组剩余大鼠随访肝功能变化并进行生存分析。结果：肝脏肿瘤移植术后14天,MRI检查显示40只大鼠肝内均可见肿瘤生长,成瘤率100%。肝脏肿瘤在T1WI上呈低信号,在T2WI上呈高信号。T2WI显示肝脏肿瘤平均直径8.16±0.09 mm,肿瘤平均体积201.80±7.68 mm3。TAE能明显抑制肝脏肿瘤的生长,但是肺转移明显高于对照组,残癌组织发生上皮间质转化(EMT), E-cadherin表达降低,N-cadherin、Vimentin表达增加。联合使用ATO腹腔注射能明显抑制TAE后EMT的发生,减少肺转移。Western blot和免疫组化结果显示ATO能抑制EMT调节转录因子Twist的表达。结论：TAE术后缺氧引起残癌细胞发生EMT,导致HCC的转移潜能增加,而ATO能抑制TAE后残癌侵袭和转移的增加,其机制可能是通过抑制转录因子Twist的激活从而抑制EMT的发生。TAE后联合ATO具有显著的抗肿瘤作用,能抑制肝癌的进展和远处转移。