【摘 要】
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凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是世界第一养殖虾类,同时也是我国对虾养殖产业的主要养殖品种。近年来,随着对虾养殖规模的不断扩大以及高密度、集约化养殖的快速发展,导致了养殖环境的恶化和病害的频发,严重制约对虾产业健康和可持续发展,开展对虾先天性免疫系统及免疫机理的研究,可以为对虾养殖疾病的防治提供新的思路、策略和途径。酚氧化酶作为一类重要的体液免疫因子,在无脊椎动物先天性免疫防
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凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是世界第一养殖虾类,同时也是我国对虾养殖产业的主要养殖品种。近年来,随着对虾养殖规模的不断扩大以及高密度、集约化养殖的快速发展,导致了养殖环境的恶化和病害的频发,严重制约对虾产业健康和可持续发展,开展对虾先天性免疫系统及免疫机理的研究,可以为对虾养殖疾病的防治提供新的思路、策略和途径。酚氧化酶作为一类重要的体液免疫因子,在无脊椎动物先天性免疫防御中发挥重要作用。无脊椎动物中主要存在酪氨酸酶和漆酶两类酚氧化酶。目前对虾酚氧化酶的研究主要集中在酪氨酸酶,同属于酚氧化酶家族成员的漆酶,在对虾中少见报道。本论文以凡纳滨对虾为研究对象,开展了漆酶LvLac1a/1b基因克隆及生物信息学分析、LvLac1a/1b在对虾先天性免疫中的功能及NFкB信号通路对LvLac1a/1b表达调控的研究,主要研究结果如下:（1）克隆获得了凡纳滨对虾两种漆酶基因LvLac1a和LvLac1b的cDNA全长。LvLac1a和LvLac1b的ORF全长为1833 bp和1824 bp,分别编码长度为610aa和607 aa的蛋白质,N端分别存在一个17 aa和18 aa的信号肽。LvLac1a和LvLac1b具有典型漆酶共有的3个铜氧化酶结构域,且存在高度保守的4个由组氨酸和半胱氨酸构成的铜离子结合位点,两者氨基酸序列相似度为68.47%,不属于可变剪切体。基因组结构分析显示LvLac1a和LvLac1b基因组编码区均包含12个外显子和11个内含子。系统进化树结果表明LvLac1a和LvLac1b与昆虫漆酶进化关系较为接近。q PCR和半定量PCR检测发现LvLac1a和LvLac1b在肝胰腺中的相对表达量较高。（2）WSSV和Vibrio parahaemolyticus分别感染对虾,与对照组相比,LvLac1a和LvLac1b在血细胞、肝胰腺及鳃组织中的表达显著上调。ds RNA分别干扰LvLac1a和LvLac1b的表达,再用WSSV和V.parahaemolyticus分别感染对虾,与GFP对照组相比,干扰组对虾累计死亡率显著上升,WSSV拷贝数和细菌负荷量也显著增加。共干扰LvLac1a/1b的表达,共干扰组与单独干扰组相比,对虾累计死亡率、WSSV拷贝数和细菌负荷量进一步显著增加,表明LvLac1a和LvLac1b参与了对虾抗WSSV和抗V.parahaemolyticus免疫防御,且LvLac1a和LvLac1b存在正向协同作用。（3）经原核重组蛋白表达系统,分别重组表达了LvLac1a和LvLac1b蛋白,重组蛋白rLvLac1a和rLvLac1b主要以包涵体形式存在。以ABTS、丁香醛连氮及对苯二酚为底物,检测经纯化、复性后的rLvLac1a和rLvLac1b漆酶活性,结果显示rLvLac1a和rLvLac1b无催化三种底物反应的能力,表明rLvLac1a和rLvLac1b不具有漆酶活性。分别将没有酶学活性的rLvLac1a和rLvLac1b与WSSV混悬液共孵育后注射感染对虾,与BSA对照组相比,rLvLac1a和rLvLac1b实验组对虾累计死亡率和WSSV拷贝数均显著下降,表明rLvLac1a和rLvLac1b可以以非酶活依赖的方式参与对虾抗WSSV免疫防御。（4）Genome Walking克隆获得LvLac1a和LvLac1b的启动子序列,生物信息学预测LvLac1a和LvLac1b的启动子区分别存在3个和1个潜在的转录因子NFкB结合位点。双荧光素酶报告基因结果显示LvLac1a和LvLac1b的启动子区均存在转录因子Lv Dorsal、Lv Relish的结合位点。分别将Lv Dorsal、Lv Relish和LvLac1a、LvLac1b的启动子区共转染果蝇S2细胞后,启动子的活性相对于对照组明显升高;启动子截短突变实验表明LvLac1a和LvLac1b的启动子区均存在一个NFкB结合位点。ds RNA注射分别干扰对虾Lv Dorsal、Lv Relish的表达,血细胞和肝胰腺中LvLac1a和LvLac1b的表达量均不同程度下调。以上实验结果表明对虾NFкB信号通路参与了LvLac1a和LvLac1b的表达调控。综上所述,凡纳滨对虾漆酶LvLac1a和LvLac1b参与了对虾抗WSSV和抗细菌免疫防御,且LvLac1a和LvLac1b参与抗WSSV的功能可以不需要其酶学活性的参与,此外,NFкB信号通路正向调控了漆酶LvLac1a和LvLac1b的表达。以上研究结果提升了对虾中酚氧化酶新的认知,为防控对虾WSSV新策略的开发提供了理论基础。
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